1

MTODOS
CROMATOGRFICOS

INTRODUCCIN

La Cromatografa es una tcnica de

anlisis qumico utilizada para separar
sustancias puras de mezclas complejas.
Esta tcnica depende del principio de
adsorcin selectiva.
La cromatografa fue descubierta por el
botnico ruso, de origen italiano, Mijal
Tswett en 1906, pero su uso no se
generaliz hasta la dcada de 1930.

En general, se emplea una fase

estacionaria y una fase mvil.
Las separaciones estn basadas en las
diferencias en la velocidad de migracin,
entre los componentes de la muestra.
La fase mvil puede ser lquida o gaseosa.
Tswett separ los pigmentos de las plantas
(clorofila), vertiendo extracto de hojas
verdes en ter de petrleo, sobre una
columna de carbonato de calcio en polvo
en el interior de una probeta.

CLASIFICACIN

Cromatografa en columna
La fase estacionaria se mantiene dentro de
un tubo angosto y la fase mvil es forzada
a pasar a traves del tubo, bajo presin o
por gravedad.
Cromatografa planar
La fase estacionaria est sostenida por una
placa plana o en los poros de un papel, la
fase mvil se mueve por capilaridad o
gravedad.

Clasificacin
general

Mtodo
especfico

Fase
estacionaria

Tipo de 5
equilibrio

Cromatografa
lquida (CL)

Lquido-lquido, o
particin

Lquido adsorbido
sobre un slido

Particin entre
lquidos inmisciles

Lquido-fase unida

Especies orgnicas
unidas a una
superficie slida

Particin entre
lquido y superficie
unida

Lquido slido o
adsorcin

Slido

Adsorcin

Intercambio de
iones

Resina de
intercambio inico

Intercambio inico

Exclusin por
tamaos

Liquido en
intersticios de un
slido polimrico

Particin/tamizado

Clasificacin
general

Mtodo
especfico

Fase
estacionaria

Tipo de 6
equilibrio

Cromatografa
gaseosa (CG)

Gas-lquido

Lquido adsorbido
sobre un slido

Particin entre gas

y lquido

Gas-fase unida

Especies orgnicas
unidas a una
superficie slida

Particin entre
lquido y superficie
unida

Gas-slido

Slido

Adsorcin

Especies orgnicas
unidas a una
superficie slida

Particin entre
fluido supercrtico
y superficie unida

Cromatografa
fluida
supercrtica
(CFS)

Seal en el
detector

tiempo

VELOCIDADES DE MIGRACIN DE LOS SOLUTOS

8

En la separacin de solutos, la efectividad de la

columna cromatogrfica, depende en parte de
las velocidades relativas a las cuales las
especies son eluidas.
Estas velocidades son determinadas, a su vez, por
las relaciones de particin de los solutos entre
las dos fases.

Relaciones de particin
La separacin se basa en diferencias
del grado de distribucin, de los
solutos, en la fase mvil y la
estacionaria.
Para
A
A una especie
A
mvil

estacionaria

La constante de equilibrio K para esta

reaccin se llama relacin de
particin o coeficiente de particin.

Coeficiente de particin
K = Cs / Cm
En donde:
Cs =concentracin molar analtica de
un soluto en la fase estacionaria
Cm= Concentracin analtiva en la
fase mvil
Idealmente, la relacn de particin es
constante en un intervalo amplio de
concentraciones de soluto; Cs es
directamente proporcional a Cm.

1
0

Tiempo de retencin

1
1

tR
tM

tM = tiempo muerto
tR = tiempo de retencin
Velocidad lineal promedio de migracin del soluto, v
v = L / tR
L = longitud del empaque en la columna
Velocidad lineal promedio, u, de las molculas de la fase mvil
u = L / tM

1
La velocidad de migracin de un soluto es funcin de la
2
relacin de particin as como una funcin de los
volumenes de las fases estacionaria y mvil.
v = uX

_____1_____
1+ KVS / VM

_____1_____
1+ KVS / VM

= fraccin de tiempo en el que el soluto

transcurreen la fase mvil

Factor de capacidad
Parmetro experimental, se emplea para describir
las velocidades de migracin de solutos en
columnas.
En una especie a el factor de capacidad es kA

kA = KA VS
VM
v=uX

1 _
1+ kA

1
3

v=uX

1 _
1+ kA

1
4

v = L / tR
u = L / tM
L / tR = L / tM X
1 _
1+ kA

tR tM
kA =
tM

tR y tM se obtienen a partir de un cromatograma

Cuando kA es <1 la elucin es rpida.
Cuando kA > 20-30 los tiempos de retencin son largos
Cuando kA esta entre 1 y 5, la separacin es ideal.

1
5
Los factores de capacidad (k),en la cromatografa gaseosa
se pueden variar cambiando las temperaturas y el
empaque de la columna.
En la cromatografa lquida los factores de capacidad ( k)
pueden manipularse, variando la composicin de la fase
mvil y de la fase estacionaria.

Factor de selectividad (velocidades1

relativas de migracin)
6

=KB / KA

= kB / kA

KA es la relacin de particin de la especie que es

eluida ms rpidamente.
kB y kA son los factores de capacidad para B y para
A, cuya sostitucin, con respecto a tiempos
tenemos:
=

(tR)B tM
(tR)A - tM

Esta expresin puede detrminarse a partir de un

cromatograma experimental.

Eficiencia de la columna
N= L/H

1
7

H =altura de un plato
N =numero de platos tericos
L =longitud del empaque de la columna
La eficiencia de las columnas se incrementa a medida que
se hace mayor el N y a medida que H se hace menor.

Altura de plato, H

1
8

La eficiencia de la columna se refleja en la anchura de los

picos cromatogrficos.
H = 2 / L

(L - 1)

= LW / 4tR

(L + 1)

= desviacin estand
2 = varianza

Numero de platos, N
A partir de un cromatograma se puede determinar N

1
9

tR
tM

W
tiempo
N = 16

tR
W

tM = tiempo muerto
tR = tiempo de retencin

W= anchura del pico en su base, en unidades de tiempo

2
Variables que afectan la eficiencia de
0

la
columna
Velocidad de flujo de la fase mvil.

El grado de ensanchamiento de la banda

depende del tiempo en que la fase mvil est
en contacto con la fase estacionaria. La
eficiencia mxima de la cromatografa de
liquidos, ocurre a velocidades inferiores que
las requeridas para la cromatografa de gases.
Las columnas en CG pueden tener una longitud
de 50m o ms, mientras que las de CL no
pueden ser ms largas de 25-50cm, debido a
la elevada presin de las gotas sobre ellas.

Otras variables
Si se disminuye el tamao de la particula del
empaque se incrementa la eficiencia de la
columna, empleando capas ms delgadas de la
fase estacionaria y abatiendo la viscisidad de la
fase mvil.

2
1

0.6-0.8mm

Altura
De
plato

0.1-0.15mm
5

Velocidad lineal cm/s

20

El incremento de la temperatura tambin reduce

el ensanchamiento de la banda en la mayora de
los casos.

RESOLUCIN DE COLUMNAS

2
2
Medicin cuantitativa, en una columna, de la capacidad
para separar analitos.

Rs =

=
2Z
WA + WB

2((tR)B (tR)A)
WA +estacionaria
WB
La resolucin para una fase
dada se puede

mejorar alargando la columna, incrementando el

numero de platos, sin embargo, se requira ms tiempo
para la resolucin.

Resolucin
A

Rs= 0.75

//
A

Rs= 1

//
Z

(tR)A
A

tM

//
//

WA

WB
Tiempo

Rs= 1.5

2
3

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA
2
4
La cromatografa es una herramienta para la separacin de
especies quimicas estrechamente relacionadas.
Puede emplearse para la identificacin cualitativa
(presencia o ausencia de componentes) y la
determinacin cuantitativa (comparacin con
estandares) de especies separadas.

Anlisis cuantitativo
Altura de pico.
Debe controlarse la temperatura de la columna

la velocidad del eluyente

2
5

la velocidad de inyeccin
Errores relativos del 5-10%

Area de pico.
El area de pico es inependiente de

los efectos de las variables anteriores

Para picos simetricos

A= h*a

Es ms satisfactorio y las areas

se determinan facilmente

Calibracin con estandares a

Mtodo de estandar interno
Mayor presicin, el pico del estandar debe estar separado pero cercano al pico del
analito
Error relativo 0.5-1%

CROMATOGRAFA DE GASES
2
6

Registrador

Jeringa
Detector

Regulador
de presin
Inyector

Suministro
del gas
acarreador

Electrmetro
O
puente

Sistema de
adquisicin
de datos
Columna

Suministro de gas acarreador

El gas debe ser quimicamente inerte. He, Ar, N 2 e H2.
Se contienen en tanques presurizados.
Se requieren reguladores de presin, calibradoresy
medidores de flujo para controlar la velocidad.
Presiones de entrada: 0.7 3.5 Kg /cm2
Velocidad de flujo: 25-50 mL/min.

2
7

Inyeccin de muestras

2
8

La inyeccin lenta o en cantidad exesiva causan el

ensanchamiento de la banda y una resolucin
pobre.
Se utilizan microjeringas calibradas para inyectar
muestras liquidas o gaseosas.
El inyector debe mantenerse a una temperatura
alrededor de 50C por arriba del punto de
ebullicin del componente menos voltil.
Para columnas empacadas normales el tamao de
muestra oscila desde decimos de L a 20 L.
Las columnas capilares requieren menor cantidad
de muestra.

Columnas tubulares abiertas,

capilares
Son fabricadas de vidrio o slice
fundida, tienen diametros interiores
de 0.25 a 0.50mm y longitudes de
25 a 50m. La fase estacionaria se
encuetra fija en la superficie interna.
Los capilares de silicio tienen paredes
ms delgadas que los tubos
metlicos, y estan recubiertos de
poliimida lo que le da mayor
resistencia. Por ser flexibles y
fuertes, pueden enrrollarse en
bobinas. La mayor ventaja de stas
columnas es su mnima tendencia a
adsorber molculas de analitos.

2
9

Termoesttica

3
0

L atemperatura de la columna debe

controlarse (hasta en dcimos de grado)
para reproducir los tiempos de retencin.
La columna embobinada se guarda en una
estufa de temperatura ajustable.
La temperatura depende de los puntos de
ebullicin de los componentes de la
mezcla.
Para mezclas con intervalos amplios de
puntos de ebullicin, es necesario un
programa para el control de temperatura.
La resolucin ptima se da a bajas
temperaturas, pero resultan tiempos de
elucin largos.

Efecto de la temperatura sobre los 3

cromatogramas
4
1
2
1

x4

Isoterma a 45C

|0
|0

10|
|60

Isoterma a 145C

9
Programa de 30
a 180C

20|
|90

|120

30|
|150

|180

tiempo, min
temperatura, C

Detectores
1. CARACTERSTICAS DEL DETECTOR IDEAL

3
2

El detector ideal en cromatografa de gas tiene las siguientes caractersticas:

Sensibilidad adecuada: Lo que constituye la sensibilidad adecuada no puede
describirse en trminos cuantitativos. En general, las sensibilidades de los
detectores actuales estn en el rango de 10 -18 a 10-15 g de analito/s.
- Buena estabilidad y buena reproducibilidad.
- Una respuesta lineal al analito por encima de varios rdenes de magnitud.
- Un rango de temperatura del cuarto de por lo menos 400 C.
- Un tiempo de la respuesta corto, independiente de proporcin de flujo.
- Alta fiabilidad y facilidad de uso.
- Similitud en respuesta, muy predecible y selectiva hacia uno o ms clases
de analitos.
- No destructivo.
- El ruido de fondo bajo y facilidad de funcionamiento

CLASIFICACIN DE DETECTORES

3
3

Hay muchos tipos de detectores que se usan en cromatografa

de gases. La razn para esta variedad involucra la
necesidad de los sistemas de deteccin de proporcionar
respuestas selectivas a los grupos particulares de
compuestos, simplificando los cromatogramas de las
muestras complejas. Los diferentes detectores dan
diferentes tipos de selectividad. El grado de selectividad
puede clasificarse como sigue.
No-selectivo (o universal) los detectores responden a todos los
compuestos que difieren del gas acarreador : TCD
Los detectores selectivos responden a un rango de
compuestos que tienen algn qumico comn o una
propiedad fsica: ECD, NPD, FPD,
Los detectores especficos responden a un solo compuesto
qumico.

Detectores dependientes de la
concentracin: TCD, ECD, FID

3
4

Adems la selectividad, los detectores pueden

clasificarse segn la forma en que responden a
la cantidad de analito que atraviesa.
Los detectores producen una seal que se
relaciona con el tiempo y la concentracin de
soluto presente en gas acarreador, en un punto.
Normalmente son no-destructivos y as que
pueden usarse en serie con otros detectores.
Su respuesta se expresa en unidades de seal por
la concentracin del analito. Debido a su
sensibilidad a la respuesta del analito, cualquier
dilucin del effluente de la columna con un gas
bajar la respuesta.

Detectores dependientes del

flujo de masa: FID, NPD, FPD
Estos detectores producen una seal que
se relaciona a la proporcin a la que las
molculas del soluto entran en el
detector.
Estos detectores normalmente generan
una seal como resultado de algn
proceso destructivo que ocurre en las
molculas del soluto.
Su respuesta se expresa en unidades de
seal por el flujo de masa del analito.

3
5

Detectores
Detector
Detector
Detector
Detector
Detector
Detector
Detector
Detector
Detector

3
6

de Ionizacin de llama (FID)

Nitrgeno Fosforoso (NPD)
de Captura de electrn (ECD)
de Conductividad termal (TCD)
fotemetrico de Llama (FPD)
de Emisin atmica (AED)
de Fotoionization (PID)
de Conductividad elctrica (ELCD)
de espectrometra de masas (MS)

FID
El FID es uno de los
detectores
ampliamente usados,
generalmente
aplicables para
cromatografa de
gases. Es fcil de usar
pero es destructivo de
la muestra. FIDs
consisten en una
llama de
hidrogeno/aire y un
plato colector.

3
7

FID

3
El efluente de la columna, se mezcla con hidrgeno y aire,
8
y entonces es encendido elctricamente. La mayora de
los compuestos orgnicos producen iones y electrones
que pueden conducir electricidad a travs de la llama.

Hay un electrodo sobre la llama que es colector de los

iones formados a una llama de hidrogeno/aire. El
nmero de iones que llegan al colector es moderado y
se genera una seal.
La cantidad de iones producida es aproximadamente
proporcional al nmero de tomos del carbono
reducidos presente en la llama y del nmero de
molculas.

FID

3
Los grupos funcionales, como carbonil, alcohol, halgeno,
y amina, rinden menos iones o ninguno en una llama.9
Adems, el detector es insensible hacia gases
incombustibles como H2O, CO2, SO2 y NOx.

Selectividad: Compuestos con enlaces C-H. Una respuesta

pobre para compuestos organicos que contienen poco o
nada de hidrgeno (ej., hexachlorobenzeno).
Sensibilidad: 0.1-10 ng
Gases: Combustin - el hidrgeno y aire; Composicin helio o nitrgeno
Temperatura: 250-300 C; 400-450 C para los anlisis
de temperatura altos.

TCD

4
0

Un TCD es un detector muy primitivo utilizado en

cromatografa de gases y todava tiene amplias
aplicaciones.
Se basa en los cambios de la conductividad trmica de un
flujo de gas.
Cambios en conductividad trmica por la presencia de
analitos. Las molculas orgnicas causan un aumento de
temperatura en el elemento, que se da como un cambio
en resistencia.
El TCD no es tan sensible como otros detectores pero es noespecfico y no-destructivo.
La ventaja del detector, es su simplicidad, su rango
dinmico lineal grande, su respuesta general a las
especies orgnicas e inorgnicas y su carcter no
destructivo que permite la coleccin de solutos despus
de la deteccin.

TCD

4
1

Una clula del descubridor contiene un filamento

elctricamente acalorado cuya la temperatura a
poder elctrico constante depende en la
conductibilidad termal del gas circundante.
Las conductividades trmicas de helio y hidrgeno
son seis a diez veces mayor que aquellas de la
mayora de los compuestos orgnicos.
As, en la presencia de incluso cantidades pequeas
de materiales orgnicos, representa una
disminucin relativamente grande en la
conductividad trmica del efluente de la columna;
por consiguiente, el descubridor sufre un marcado
aumento en su temperatura.

4
El circuito del puente
permite
2
amplificacin de
cambios de
resistencia debido a
analitos que pasa
sobre el
termoconduccin de
la muestra y no
amplifica cambios
en resistencia que
ambos juegos de
producto de los
detectores debido a
fluctuaciones de
proporcin de flujo

TCD

4
3

Selectividad: Todos componen salvo el gas del portador

Sensibilidad: 5-20 ng
Gases: Composicin igual que el gas acarreador.
Temperatura: 150-250 C

ELCD
Los compuestos son
mezclados con un gas de
la reaccin y atraviesan
un tubo de reaccin de
alta temperatura. Se
crean productos de la
reaccin especficos qu
se mezcla con un solvente
y atraviesan una celda de
conductividad
electroltica. El cambio en
la conductividad
electroltica del solvente
es moderado y se genera
una seal.

4
4

ELCD

4
5

ELCD
Selectividad: Los halgenos, azufre o
nitrgeno que contienen compuestos. nico
en un momento.
Sensibilidad: 5-10 pg (halgenos); 10-20 pg
(S); 10-20 pg (N)
Gases: Hidrgeno (halgenos y nitrgeno); el
aire (azufre)
Temperatura: 800-1000 C (halgenos); 850925 C (N); 750-825 C (S)

4
6

ECD

4
Detector de captura de electrnes (ECD) 7
opera en mucho de la misma manera
como un medidor de radiacin-X.
Aqu el efluente de la columna pasa por un
-emisor, como 63Ni o tritium (absorbido
en platino o lamina del titanio). Un
electrn del emisor causa ionizacin del
gas del portador (a menudo el nitrgeno)
y la produccin de un estallido de
electrones.

ECD

4
El detector de captura de electrnes fue el primer
8
detector selectivo inventado para el cromatografa
de gas.
La cmara interior del detector se disea tan
pequeo como sea factible y est radiado con un
beta-emisor radiactivo contenido es una lamina
sellada. La fuente normalmente es 3H o 63Ni.

ECD

Selectividad: Halgenos, nitratos y carbonilos

Sensibilidad: 0.1-10 pg (en compuestos

halogenados); 1-100 pg (nitratos); 0.1-1 ng
(carbonilos)

Gases: Nitrgeno o argn / metano

Temperatura: 300-400 C

4
9