PCR EN TIEMPO REAL

quantitative polymerase chain reaction

 La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas
iniciales en inglés son PCR ("polymerase chain
reaction"), es una técnica que fue
desarrollada por Kary Mullis a mediados de
los años 80. Con esta metodología se pueden
producir en el laboratorio múltiples copias de
un fragmento de ADN específico, incluso en
presencia de millones de otras moléculas de
ADN.
 Es una variante de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada
para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma
absoluta el producto de la amplificación de
ácido desoxirribonucleico (ADN).
Para llevar a cabo esta basado en la utilización de otro
fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte
intermedia del ADN que queremos amplificar.
 Esta sonda lleva adherida una molécula
fluorescente y otra molécula que inhibe esta
fluorescencia ("quencher"), de tal forma que
sólo cuando la sonda es desplazada de su
sitio por acción de la ADN polimerasa la
molécula fluorescente se libera de la acción
del "quencher" y emite fluorescencia al ser
iluminada con un láser.
FUNDAMENTO
 La PCR cuantitativa se realiza en un
termociclador con capacidad de hacer incidir
sobre cada muestra un haz de luz de una
longitud de onda determinada y de detectar la
fluorescencia emitida por el fluorocromo
excitado. Este termociclador es un aparato con
capacidad para calentar y enfriar rápidamente
las muestras, de modo que se aprovechen las
cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos
y las enzimáticas de la ADN polimerasa.
CLASIFICACION
 Podemos clasificar las técnicas de PCR
cuantitativa según el empleo de fluorocromos
no específicos o bien de sondas moleculares
dependientes de la secuencia.
 En las técnicas basadas en fluorocromos
inespecíficos se detecta la generación
exponencial de ADN de doble cadena
empleando un fluorocromo que se une
inespecíficamente a aquél. Un ejemplo de
colorante que permite esta detección es el
SYBR Green), que excitado mediante luz azul
(λmax = 488 nm) emite luz verde (λmax = 522
nm).
 Las técnicas basadas en sondas específicas
utilizan al menos un oligonucleótido marcado
fluorescentemente. Típicamente esta sonda
está unida a dos fluorocromos e hibrida en la
zona intermedia entre el cebador directo
(forward) y el inverso (reverse); esto es, en el
amplicón. De este modo, cuando la sonda
está intacta, presentan una transferencia
energética de fluorescencia por resonancia (
FRET).
 Las sondas de hidrólisis, frecuentemente
empleadas en esta técnica, son
oligonucleótidos que presentan fluorocromos
en ambos extremos y tienen una secuencia
complementaria a parte del fragmento de
ADN que se quiere amplificar.
 Uno de los fluorocromos actúa como donador
de fluorescencia en el extremo 5’ y el otro
como aceptor de esta fluorescencia en el
extremo 3’.
 La ADN polimerasa se desplaza sobre la
cadena de ADN sintetizando la cadena
complementaria a partir de un fragmento de
ADN que sirve de molde (cebador). Al llegar al
punto en el que la sonda se ha hibridado, la
hidroliza. El fluorocromo del extremo 5’ de la
sonda (el donador) es liberado.
 El fluorocromo aceptor no puede entonces
absorber la fluorescencia del donador por
estar alejado de él espacialmente. Un detector
realiza la medida de esta emisión de
fluorescencia, que es proporcional a la
cantidad de ADN presente, y la representa
gráficamente.