TINCIONES

QUE ES UN COLORANTE?

Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a

clulas, tejidos, fibras, etctera. De acuerdo con su origen, se
pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extrados
de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos
de minerales procesados y manipulados en el laboratorio.
Qumicamente, el colorante est constituido de un componente
cromforo y un auxcromo. El cromforo es todo grupo aislado,
covalente e insaturado, que tiene una absorcin caracterstica en
la regin ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la
capacidad que tiene la molcula para que sus electrones
absorban energa o luz visible, se exciten y emitan diversos
colores de acuerdo con la longitud de emitida como resultado del
cambio en el nivel energtico.

FUNCIONES

1. Permiten hacer visibles a los objetos microscpicos

y transparentes.

2. Revelan su forma y tamao.

3. Muestran la presencia de estructuras internas y

externas.

4. Producen reacciones qumicas especficas.

A continuacin se mencionarn las principales tcnicas

de tincin utilizadas en microbiologa, as como
su fundamento e interpretacin para realizar la correcta
identificacin de los microorganismos.

TINCION DE GRAM

Esta tincin es un procedimiento de gran utilidad empleado en los

laboratorios donde se manejan pruebas microbiolgicas. Es definida
como una tincin diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a
las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y
bacterias Gram positivas. Fue desarrollada por el cientfico dans Hans
Christian Gram en 1884; hoy en da, sigue siendo una de las tinciones
ms utilizadas universalmente debido a lo econmico, sencillo y eficaz
que resulta. En microbiologa clnica resulta de gran utilidad, ya que a
partir de muestras clnicas directas provenientes de sitios estriles se
puede saber de manera rpida las caractersticas de la muestra y hacer
una diferencia de los potenciales microorganismos causantes de una
infeccin.12 Los principios de la tincin de Gram estn basados en las
caractersticas de la pared celular de las bacterias, la cual le confi ere
propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared celular de
las bacterias Gram negativas est constituida por una capa fi na de
peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las
bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida
por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; as
pues, la composicin qumica y el contenido de peptidoglicano en la
pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica
y determina las caractersticas tintoriales.

EN QUE SE BASA?
La tincin de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene
afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el
cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formacin de un
complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared
bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la
pared bacteriana y cierra los poros de la misma, tambin destruye la membrana externa
de las bacterias Gram negativas debido a que sta es soluble a la accin de solventes
orgnicos, como la mezcla de alcohola-cetona. Las bacterias Gram positivas, al contener
una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras
que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano.
Por ltimo, se coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contra
tincin y sirve para teir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violetayodo. Hay bacterias de un mismo gnero que pueden observarse en la misma muestra
como Gram positivas y como Gram negativas, a este evento se le llama tincin Gram
variable secundaria a alteracin en nutrientes, temperatura, pH o concentracin de
electrolitos. No todas las bacterias se pueden teir por esta tcnica, ya que carecen de pared
celular (micoplasma) o su pared celular tiene una composicin qumica diferente (micobacterias,
que cuentan con una gran cantidad de cidos miclicos).18,19 Las muestras tiles para su uso son
lquidos estriles, biopsias para cultivo, abscesos, hisopados, crecimiento de colonias aisladas en
medios de cultivo. Las bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado,
mientras que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo.

Tincin de Wright

La tincin de Wright es una tcnica que se emplea generalmente para la diferenciacin de

elementos celulares de la sangre y es clasificada como una tincin policromtica, dado
que puede teir compuestos cidos o bsicos presentes en una clula. Fue desarrollada
por el patlogo James Homer Wright en 1902 a partir de la modificacin de la ya existente
tincin de Romanowsky, utilizada para diferenciar elementos formes de la sangre. Esta
tincin tiene diversos usos en microbiologa; en la parasitologa, se le emplea en la
bsqueda de hematozoarios como Plasmodium spp. El reactivo de Wright est compuesto
por eosina y azul de metileno, cuando ste se oxida se conoce como azur B a una
concentracin de 0.8 g/L empleando como solvente alcohol metlico. La eosina es un
colorante cido que tiene afinidad por componentes alcalinos. Existen dos compuestos
conocidos como eosina y que estn intrnsecamente relacionados: eosina Y, conocida
tambin como tetrabromofluorescena o, comnmente, eosina amarilla, y la eosina B,
conocida como dibromodinitrofluorescena o eritrosina B azulada. Ambos compuestos son
intercambiables, sin que sean notables las diferencias entre ellos en el resultado de la
tincin, por lo que la preferencia de una sobre otra no sigue un criterio objetivo. A pesar
de ello, la eosina Y es la ms utilizada en procedimientos rutinarios. Es un compuesto
cido cuya propiedad est basada en su polaridad negativa, lo que le permite enlazarse
con constituyentes celulares de carga positiva; por esta razn, colorea componentes
citoplasmticos y se les conoce como acidfilos. La tonalidad resultante de la tincin con
eosina es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo intenso en el caso de los eritrocitos.
El tpico color de los ncleos celulares, mayoritariamente morado, se basa en la
interaccin molecular entre eosina y un complejo azul de metileno-DNA. La intensidad de
la coloracin depende del contenido de azur B y de la relacin con la eosina amarilla.

La tincin de Ziehl-Neelsen es la tcnica comnmente usada en el

diagnstico rutinario de tuberculosis. Es una tcnica rpida, fcil y de bajo
costo, lo que permite que se pueda realizar en casi cualquier laboratorio
clnico. Esta tincin permite diferenciar a las bacterias en dos grupos:
aquellos que son capaces de resistir la decoloracin con alcohol-cido y
aquellos que no lo son. La sensibilidad de esta tincin para identificar
bacilos cido-alcohol resistentes es del 74% y la especificidad del 98%,
teniendo un lmite de deteccin de 5,000-10,000 bacilos/mL de muestra.
La tincin se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparacin
ligeramente para solubilizar las ceras, lpidos y otros cidos grasos de la
pared celular para que permita el paso libre del colorante, el cual tiene
una enorme afinidad por los cidos miclicos presentes en la pared. Al
enfriar con agua, los componentes de la pared vuelven a solidificar,
resistiendo la accin abrasiva del alcohol-cido, y el azul de metileno se
utiliza como contratincin

La tincin negativa fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el fi n de rodear y
delinear las bacterias no teidas u otros materiales biolgicos.6 Utilizamos diferentes mtodos de tincin
negativa para evaluar estructuras individuales, tan pequeas como las vesculas sinpticas e incluso de
gran tamao, como los microorganismos unicelulares. Este mtodo es muy til, aunque est limitado por
la presencia de un fondo oscuro que no permitir la correcta identifi - cacin de forma ntida y detallada
de los componentes de dichas estructuras.29 En microbiologa, la tincin negativa proporciona un
resultado presuntivo de la presencia de Cryptococcus neoformans, microorganismo causante de
meningitis en pacientes con inmunosupresin, siendo la tcnica ms utilizada para poner de manifi esto
su cpsula. Este hongo presenta dos formas durante su ciclo vital: una forma asexual y una forma
sexual; en la primera se presenta como levaduras encapsuladas que se reproducen por gemacin y
puede ser visualizada por medio de la tinta china.29-31 El principio es simple, ya que slo se requiere
depositar una gota de la muestra clnica sobre un portaobjetos, posteriormente se coloca el colorante y
se observa al microscopio sin necesidad de fi jacin, algunas estructuras difundirn el colorante y otras
no, lo que permitir un contraste de las estructuras observadas. Se han utilizado diferentes colorantes:
uno de ellos es la mencionada tinta china, la cual tie el fondo de la muestra de un color oscuro y la
cpsula del C. neoformans permanece sin teir. La principal difi cultad con la tincin negativa es que los
microorganismos tienden a contraerse durante el periodo de secado;31 para evitarlo, se ha optado por
usar la tincin negativa hmeda, en la cual los organismos se suspenden en una pelcula de tinta china o
mancha oscura y el contorno de la cpsula puede ser observado sin el peligro de contraccin. Adems
de ser una tcnica sencilla, es muy barata, ya que no requiere equipos o material costoso para su
realizacin.