Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Histrico
1955, Smithies
1967, Loening
Vou ali
correr um
gelzinho e
j volto
Tenho que ir
seno vou perder
meu gel
Eletroforese
Movimento de partculas
dispersas num fludo sob
influncia de um campo eltrico
uniforme
DNA, carga negativa
Tem tendncia a se dirigir ao
polo positivo quando sujeito a
um campo eltrico
Eletroforese, etapas
1.Preparao do gel
2.Aplicao das amostras
3.Eletroforese
4.Colorao
5. Anlise dos resultados
Preparao
do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
Definio do mapa
das amostras por
canaleta
Corrida do gel
Aplicao do campo
eltrico
Fonte eltrica gera
fluxo de ons atravs
da soluo tampo
Terminais positivo e
negativo
Tempo adequado,
seno o DNA sai do gel
Prata
Gel SDS-PAGE
PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
Melhor resoluo
Eletroforese em campo
pulsado
Grandes
fragmento
s de DNA
PCR
a reao em cadeia da
polimerase
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
http://dotsub.com/view/53
8a719f-927b-4192-8e95-18a
92a9e95a5
Reao em cadeia
Amplificao do DNA
Amplificao in vitro de
molculas de DNA
In vivo X In vitro X In silico
Etapas da PCR
Ciclos da PCR
Separao das fitas 96C
Anelamento dos primers
60C
Sntese do DNA 37C
Histria da PCR
Qumico, 1966
Taq
polimerase
Kary Mullis,
1944
PCR
Sistema de reao:
DNA molde (100 ng)
Iniciadores (5 M)
dNTPs
Tampo com MgCL2
Taq polimerase
Protocolo de amplificao:
Desnaturao: 95 C
Anelamento: 45-60 C
Extenso: 72 C
Interldio explicativo
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Bioqumica +
Biomol
Enzimas so protenas,
portanto:
1. So formadas por
sequncias de aminocidos
2. Derivam de informaes
dispostas por genes no
DNA, que deve ser
transcrito e,
posteriormente, traduzido
3. Podemos saber a sequncia
delas, tanto de aminocidos
quanto de nucleotdeos
917
aminocid
os
917 x 3 = 2751
3617-2751 =
866
3617 bp
3,6 kb
Sequenciamento de
protenas
Degradao de Edman
Quebra-se o aminocido N-terminal
Identifica-se o aminocido
quebrado
Sequenciamento de 50 a 70 aas
Espectometria de massa
Quebra-se a protena em diversos
pontos e verifica-se a massa dos
fragmentos
Comparaes com massas
conhecidas dos aas identifica a
sequncia dos mesmos
O Sequenciamento
de molculas de DNA
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
>gi|33869444|gb|BC008730.2| Homo sapiens hexokinase 1, mRNA (cDNA clone MGC:1724
IMAGE:3163058), complete cds
GGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCACGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCA
GCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAGCTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTGTATGCC
ATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCATAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCT
CCCGGGATTTTAATCCAACAGCCACAGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTC
TGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTGGATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAAT
CATGAGAAAAACCAGAATGTTCACATGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCA
GTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGTTGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGA
CAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACGTTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTG
ATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAGCGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAG(...)
TGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAGCCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACC
AGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCCCGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCT
TCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTGGCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGT
CCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTGTGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGT
CCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCATTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAAT
TTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTCGTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Frederick Sanger
nico vivo dentre os 4 indivduos que j
venceram dois prmios Nobel
~1955: publicou a primeira sequncia de
aminocidos da insulina
Ganhou o Nobel de qumica em 1958
O mtodo de Sanger,
1975
Polimerizao do DNA a ser sequenciado (molde)
na presena de:
DNA polimerase
primer
tampo
dNTPs (desxinucleotdeo)
ddNTPs (didesxinucleotdeo)
http://www.youtube.com/watch?v=M
z-4LSfecM4&feature=related
Amplificao interrompida
com didesoxinucleotdeos
Desoxinucleotdeos
dNTP
O didesxinucleotdeo no tem a
extremidade 3OH livre
(...)
e, portanto, no permite a
incorporao de novas bases
a 3 quando adicionado,
(...)
interrompendo a formao da
nova cadeia definitivamente
ddNTP
Didesoxinucleotdeo
C
T
G
T
A
G
A G T
T
C A
A
C
AC T
T
C A
G
G
G T
T
A
G
C
C
A
C A
C
G
T
5
3
G
A
ATGCTTC
|||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3
T T
G
C
A
C A
T
A
G T
A
AC T
T
C A
G
G
G T
G
T
C C
AG
A C C
TC A G
5
3
G
A
ATGCTTC
|||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3
A
A GA T T
C
C CA
AC T
T
G
G T
A
G
T
G C
A
G
C
A
C A
C
G
T
5
3
G
A
ATGCTTCTG
||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3
T C
C
AT G C
A T TT
T G
T
C A
T
T AC
C
CA
A GC
G
G T
G AC A
A G
A C
GC
5
3
ATGCTTCTGGCAGATCT
|||||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3
T GAA
G
A
T
T
G
T
T
T
GA G C
C
T
A
T
T C A
GT G
C C
A
GC A T
C
G
C
AC
CC
5
3
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3
A
CC
A
T
T
G
A
T
T T
G
A
G
C
T
A
C
A
T
T
A
G
T
C
G
G
GA
T
G
T
CA
C G C
C C
AC
5
3
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3
A
G
C A
G
T C
AC
T
T GAA CC
T
A
T
G
T
T
G
C
T
T
G
AA
T
C
T G
C G
GC A
C
CA
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCT
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
Populao
de
molculas
Incorpora
o aleatria
do didesxi
Quantidade
precisa
entre
didesxi e
desxi
5
ATGCTTCT
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ddGTPs
molde
polimerase
dNTPs
ddATPs
ddTTPs
ddCTPs
ATGCTTCT
ATGCTTCTG
ATGCTTCTGG
ATGCTTCTGGC
ATGCTTCTGGCA
ATGCTTCTGGCAG
ATGCTTCTGGCAGA
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATC
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
G A T C
ATGCTTCT
ATGCTTCTG
ATGCTTCTGG
ATGCTTCTGGC
ATGCTTCTGGCA
ATGCTTCTGGCAG
ATGCTTCTGGCAGA
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATC
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
Modelo original
Etapa 1
Amplificao
Tipo-PCr
Marcao do
primer
4 reaes
necessrias, uma
para cada base
Etapa 2
Eletroforese
Eletroforese
separa fragmentos
de diferentes
tamanhos
Leitura manual da
sequncia de
baixo pra cima
Modelo moderno
Applied Byosystems, 1986
Marcao fluorescente do
ddNTP
1 reao necessria, todas
as bases lidas ao mesmo
tempo
Eletroforese separa
fragmentos de diferentes
tamanhos
Leitura da automtica
sequncia, de baixo pra cima,
por um laser
http://www.youtube.com/
watch?v=ezAefHhvecM
Leroy Hood,
1938-
Cromatograma
As mquinas necessrias
para o sequenciamento
Primeira etapa: junta-se os
reagentes em poos de
placas e coloca-se na
mquina de PCR para a reao
de amplificao interrompida
Diferenas com relao ao PCR
Utilizao de um s primer
Utilizao dos ddNTPs
O que faz um
sequenciador de DNA?
Exerccio
D a sequncia de DNA da canaleta apontada
azul = Guanina
amarelo = Timina
vermelha = Adenina
verde = Citosina
http://www.youtube.com/watch?
v=dUjMf2ZezIw&feature=related