METODOS DE

DIAGNSTICO
VIROLGICO
Dra. Lizzie Becerra
Gutirrez
Ms.C. Carlos
Abanto Daz
Ms.C. Juan Giles
Saavedra

QU SON LOS
VIRUS?

DIAGNSTICO VIRAL
Elemento crucial para realizar el DX
de laboratorio de un virus es

Toma de
muestra

Procesamiento de
una muestra clnica
adecuada

PARA EL DX VIROLOGICO EN EL LABORATORIO

Es importante

Diagnstico
clnico:
Orienta
hacia la
prueba
apropiada a
realizar

Informacin epidemiolgica:
Identificacin del paciente, Edad, Sexo,
Antecedentes. Inicio de la enfermedad.
Fecha de obtencin de la muestra.
Obtener informacin si el paciente ha
recibido vacunas virales o
teraputica antiviral en una fecha
reciente.

TOMA DE
MUESTRA
OBTENCION DE
MUESTRA

EN FORMA
ASPTICA Y EN
VOLUMEN
ADECUADO

MOMENTO
ADECUADO

OBTENER LA MUESTRA
EN UN ESTADIO
TEMPRANO (72 HRS)
EN
INMUNOCOMPETENTES .
EN REACTIVACIONES
INMUNOCOMPROMETID
OS, INFECCIONES
VIRALES PERSISTENTES
O CRONICAS

CONSERVACIN Y
TRANSPORTE
ADECUADO
USAR SOLUCIONES
TAMPONADAS, CON
ANTIBITICOS Y
ANTIFNGICOS.
TRANSPORTE: EN
RECIPIENTE LIMPIO,
ESTRIL. CON HIELO
PARA SER
PROCESADAS O
COLOCARLAS EN
CONGELADORES (20 C)

ALGUNOS TIPOS DE
MUESTRAS
HISOPADO FARNGEO:
ADENOVIRUS, INFLUENZA,
SARAMPION, CITOMEGALOVIRUS,
PAROTIDITIS.
HECES:
ROTAVIRUS, ADENOVIRUS,
COXSACKIE A Y B, REOVIRUS,
POLIOVIRUS.

HISOPADOS CONJUNTIVALES

HISOPADOS DE LESIONES Y
VESICULAS

CUTNEAS

ASPIRADO NASOFARNGEO

HISOPADOS NASALES

HISPADOS FARNGEOS

HISOPADOS RECTALES

SECRECIONES OCULARES:
ADENOVIRUS, HERPESVIRUS,
SARAMPION.

HECES

ORINA

SANGRE:
HEPATITIS, VIH.

LCR

SANGRE

PIEL:
HERPES, VARICELA.

METODOS DIRECTOS
Son aquellos que detectan:
1. El virus como agente infeccioso.
2. La presencia de antgenos virales (tcnicas
inmunolgicas): Inmunofluorescencia (IF),
Enzimoinmunoanlisis (EIA), Test de
Aglutinacin.
3.La presencia de cidos nucleicos virales
(PCR, etc.).
4.El virus como partcula viral (microscopa
electrnica).

AISLAMIENTO VIRAL

Cultivos celulares

Microscopa
electrnica

VIRUS COMO
PARTICULAVIRAL

METODOS DIRECTOS

Pruebas inmunolgicas:
Inmunofluorescencia (IF),
Enzimoinmunoanlisis (EIA),
Test de Aglutinacin.

PRESENCIA DE
A.N. VIRALES

PCR,
Sondas genticas
DETECCION DE
ANTGENOVIRAL

Aislamiento viral
Los cultivos celulares se dividen en:
Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de
clulas, tejidos u rganos tomados directamente
del organismo y pueden subcultivarse una o dos
veces.
Lneas Celulares Diploides: Son aquellas que
crecen en pasajes sucesivos hasta
aproximadamente 50 subcultivos y que
conservan por lo menos en un 75% el cariotipo
correspondiente a la especie de que provienen.
Lneas Celulares Continuas: Permite un
nmero finito de subcultivos y son heteroploides.
Para considerar que se ha logrado establecer una
lnea continua, esta debe de haber sido
subcultivada por lo menos 70 veces.

Las lneas celulares continuas ofrecen las

siguientes ventajas:
Disponibilidad para todos los investigadores
de stocks de clulas idnticas, ya sea
congeladas en ampollas o en monocapa de
botella de cultivos, con la posibilidad de
reconstituirlas cuando sea necesario.
Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento
en todos los laboratorios.
Libre de contaminacin con agentes extraos.

 Cuando los virus no producen efecto

citoptico, se puede recurrir a
tcnicas que ponen en evidencia su
presencia en el cultivo. Las ms
usadas son:
Hemadsorcin
Hemaglutinacin
Tinciones con anticuerpos
monoclonales.

EXAMEN DIRECTO
se realiza de

Secreciones

Excreciones

Productos
Patolgicos

Estudia las

Alteraciones Celulares Tpicas

EXAMEN DIRECTO
Lesin Cutnea
Mucosa

Secrecin
Nasofarngea
Brnquica

Viruela
Varicela
Vacuna
Herpes

Gripe

se realiza de
Orina
Saliva

Saliva
Parotiditis

Citomegalia

CARACTERSTICAS
BIOLGICAS
HA
HAd
Neutralizacin

ESTUDIOS
ULTRAESTRUCTURA

IDENTIFICACIN
EFECTO
CITOPTICO
Alteraciones
de Clulas
Tpicas

Pruebas
serolgicas
FC
HAI
Test Neutralizacin
IFI
ELISA
Western Blotting

Centros
linfocticos
Ndulos de Babes
consistentes en
clulas gliales

Neurona sin cuerpos de Negri

Clula nerviosa infectada con el virus de la rabia con inclusiones

intracitoplasmticas (cuerpos de Negri). La tincin roja indica reas del
antgeno viral de la rabia mediante el uso de inmunohistoqumica o del
complejo avidin-biotina

Cuerpo de Negri en neurona infectada

Cuerpo de Negri en clula cerebral

Histopatologa de la rabia, cerebro. Cuerpos de Negri caractersticos estn

presentes con una clula de Purkinje del cerebelo en este paciente que
falleci por rabia.

Virus de la Rabia gemando de una

inclusin (cuerpo de Negri) al
retculo endoplsmico en una
clula nerviosa.
A. Cuerpo de Negri.
B. Abundantes
ribonucleoprotenas en la
inclusin.
C. Virus de la rabia gemando.

Ribonucleoprotena. Note las abundantes hebras enrolladas de

ribonucleoprotenas (casi todo en la imagen es ribonucleoprotena).

Test de Tzanck

METODOS INDIRECTOS
Son aquellos que reconocen la
respuesta inmune (humoral o celular)
por parte del husped:
Deteccin de anticuerpos especficos
antivirales por tcnicas
inmunolgicas (EIA, IFI, WB, etc.).
Produccin de anticuerpos in vitro.

LA ELECCION DE UNA PRUEBA

DIAGNOSTICA
En la valoracin de los diferentes
procedimientos de diagnstico
descriptos, se pueden considerar tres
parmetros de importancia
fundamental:
SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD y
VALOR PREDICTIVO.

Tcnicas para Evaluar

Inmunidad Viral

Radioinmunoensayo (RIA)
Tcnica muy sensible basada en la
competencia de unin al anticuerpo
especfico entre la sustancia a
cuantificar y cantidades conocidas de
la misma sustancia marcada con un
istopo.
A
mayor
antgeno
a
cuantificar, menor ser el antgeno
marcado unido al anticuerpo y
viceversa.

Enzimoinmunoanlisis (EIA)
Los EIA para la deteccin de antgeno
se basan habitualmente en la
captura del antgeno por anticuerpos
especficos unidos a una fase slida,
en general, un pocillo de una
microplaca o una esfera de plstico.
El antigeno presente en la muestra
se combina con el anticuerpo fijado.
El Ag se detecta con otro anticuerpo
especfico conjugado a una enzima,
se adiciona un sustrato para la

Enzimoinmunoanlisis Indirecto
(EIA)
Se han aplicado de manera amplia
en el diagnstico de anticuerpos
virales. Los antgenos virales se
inmovilizan sobre una fase slida
(policubetas), se agregan los sueros
en estudio, se incuban, se lavan y se
revela la reaccin Ag-Ac por el
agregado de una Ig antiespecie
conjugada con una enzima seguida
de un sustrato apropiado para esta.

ELISA
Permite identificar inmunocomplejos
por medio de enzimas unidas al
antgeno o anticuerpo, estando uno
de ellos adsorbido a un soporte
slido (placa de poliestireno). La
reaccin
antgeno-anticuerpo
se
detecta mediante la utilizacin de un
marcador que es una enzima
conjugada qumicamente al antgeno
o anticuerpo (peroxidasa, fosfatasa),
se aade un sustrato al cul
la
enzima convierte de incoloro a un

ELISPOT

Prueba diseada originalmente para la

deteccin de clulas B secretoras de
anticuerpos antgeno especficos.
Se ha adaptado para la deteccin de
clulas secretoras de citocinas especficas
u otros antgenos.
Incorpora el ensayo inmunoenzimtico en
fase slida ELISA.
Es un mtodo sensible y selectivo para el
estudio
de
citocinas,
no
requiere
estimulacin previa para reflejar la
situacin in vivo.

ELISPOT
Se puede utilizar para cuantificar y
monitorear respuesta de clulas T con
frecuencias del orden de 1 en 100,00,
as como clulas que secreten menos
de 100 molculas de citocina por
segundo.
El IFN- secretado por las clulas en
cultivo,
es
capturado
en
las
inmediaciones de la clulas por un
anticuerpo
especfico
antiIFN-
adsorbido en el fondo del pozo.

ELISPOT
Las clulas se retiran mediante lavados
sucesivos y se adiciona un segundo
anticuerpo especfico anti-IFN- marcado con
una enzima, el cul va a adherirse al
interfern
inmovilizado
por
el
primer
anticuerpo, al adicionar el sustrato de la
enzima se forma un producto colorido
insoluble que permite ver el sitio en donde se
encontraba la clula secretora de IFN- como
una mancha de color.

Inmunofluorescencia
Es
una
tcnica
histoqumica
o
citoqumica, til para detectar y localizar
antgenos en clulas o tejidos. Se utiliza
un anticuerpo especfico conjugado con
un compuesto fluorescente dando como
resultado un marcador sensible contra el
antgeno.
Inmunofluorescencia directa (ID). El
anticuerpo
conjugado
se
aade
directamente a la seccin de tejido o
suspensin de clulas viables.

Inmunofluorescencia
Indirecta
Se basa en la unin de anticuerpos
antivirales a los antigenos virales
expresados en la superficie y el
citoplasma de
clulas infectadas
(fijadas en un portaobjetos). til para
la determinacin de anticuerpos
antivirales en el suero del paciente.
Se incuba el suero del paciente con
las clulas infectadas y se agrega un
anticuerpo
anti-IgG
humana
conjugada con isotiocianato de

Inmunofluorescencia

Puede usarse para detectar el virus

de la influenza A y B, Parainfluenza
1,2 y 3 y Adenovirus entre otros

Virus de la influenza

La presencia de anticuerpos en el
citoplasma y superficie de las clulas
infectadas

Aglutinacin en ltex
La aglutinacin de las partculas de ltex
recubiertas por un Ag especfico permite la
deteccin de Ac libres especficos para el
Ag
Se basa en las interacciones Ag-Ac, donde
la cantidad y especificidad de la reaccin
se evala por los cambios fsicos inducidos
tras la unin del anticuerpo especfico con
su antgeno correspondiente para formar
inmunocomplejos.

Hemaglutinacin
Ciertos virus (influenza, parainfluenza y
togavirus) producen antgenos que logran
acoplarse de manera espontnea a los
eritrocitos y forman reactivos estables
para la deteccin de anticuerpos.
Esta reaccin puede inhibirse usando un
anticuerpo especfico antiviral. De esta
manera la hemaglutinacin puede usarse
para cuantificar el virus y el ttulo de
anticuerpos
contra
el
virus
hemaglutinante.

Western Blot (WB)

Con el uso combinado de
electroforsis y ELISA puede
determinarse la respuesta a una
diversidad de protenas especficas a
patgenos.
Este procedimiento proporciona un
medio especfico para identificar
reactividad de anticuerpos.

Western Blot (WB)

Se basa en la separacin de los antgenos

virales mediante una electroforesis en gel
de SDS-PAGE (lo cual proporciona una
carga negativa a la protenas).
Las protenas virales son sometidas a una
electroforesis en geles de poliacrilamida.
Como las protenas estn cargadas
negativamente se separan con base a su
peso
molecular
(las
ms
grandes
permanecen en la parte superior del gel y
las menores migran hacia la base).

Western Blot (WB)

Las protenas se transfieren a un
soporte
slido
(papel
de
nitrocelulosa, nylon), lo cual da una
copia exacta del patrn del gel en la
matriz.
La identificacin de las protenas a
estudiar se realiza usando un ELISA
indirecto. Las reacciones se leen
como positivas cuando una lnea de
precipitacin o color se forma en el
peso molecular correcto para una
protena particular.

 Detecta anticuerpos
frente a
glicoprotenas:
De la envoltura:
gp160, gp120 y gp41

Codificadas por el gen

gag
p55, p24 y p17

Protenas enzimticas

p66, p51 y p311

[OMS]

> 2 bandas de
protenas de la
envoltura [OMS]

[CDC]
Dos bandas de
protenas p24, gp41,
gp120 o gp160

EVOLUCIN Y
DIAGNSTICO DE LA
ENFERMEDAD