Fundamentos de la Reaccin en

Cadena de la Polimerasa (PCR)

M.C. Arturo Muoz Prez

Cd. Obregn, Sonora a 27 de mayo de 2015

Replicacin ADN
El ADN tiene la capacidad de formar copias de s mismo, con
el fin de que la clula mantenga su informacin gentica

Replicacin ADN

Qu es la PCR?
Es una tcnica de biologa molecular desarrollada en
1986 por el Dr. Kary Mullis, la cual nos permite obtener
un gran nmero de copias de un fragmento de ADN en
particular a partir de una molcula de ADN molde

Para que sirve?

Debido a su simplicidad PCR es una
tcnica popular con una amplia gama
de aplicaciones:
Secuenciacin
Deteccin de patgenos infecciosos
Deteccin de mutaciones
Anlisis de expresin gnica
Anlisis de diversidad gentica
Entre otros.

Equipo utilizado

Mezcla de reaccin

ADN molde
Primers u oligonucletidos
Enzima ADN polimerasa
H2O MQ
Buffer de reaccin
Cofactores (MgCl2)
dNTPs
Amortiguador

ADN molde
Molcula que contiene la regin de ADN que se va
a amplificar

Primers u
oligonucletidos
Son
secuencias
cortas,
de

entre

15-30

nucletidos.
Altamente especficos con la zona de inters.
Su funcin radica en proporcionar a la ADN
polimerasa un extremo 3 con un OH preexistente
al que se han de aadir los nucletidos
consecutivos mediante enlace fosfodister.
OH

OH

Diseo de Primers: Clculo

de Tm
Se define como aquella en la que el 50 % de los
iniciadores se encuentran en estructura de
cadena lineal. Se debe considerar Tm similar en
ambos primers y que no presente ms de 5 C de
diferencia con el fin de garantizar temperatura de
alineamiento similares.

Clculo de Temperatura de
fusin (Tm )
Tm= 2 (T+A) + 4
(G+C)
Oligonuclotido 1
ATGGCAGTTCGATCGG
TCAA
Oligonuclotido 2
TCCAGTTAACTCAAGC
CTTG

Tm= 2 (5 + 5) + 4 ( 6 + 4)
Tm= 2 (10) + 4 (10)
Tm= 60 C
Tm= 2 (6 + 5) + 4 ( 3 + 6)
Tm= 2 (11) + 4 (9)
Tm= 58 C

5 GGCACGAGGC ATGCATCTTA CGGAATCGTG

CCTGAAGACA 3
3 C CGTGCTCCG TACGTAGAAT GCCTTAGCAC
GGACTTCTGT 5
Primer 1 : 5
3
Primer 2 : 5
3

?
?

GGCACGAG
GC
TGTCTTCAG
G

Taq Polimerasa
El descubrimiento en 1976 de la Taq polimerasa,
una ADN polimerasa extrada de la bacteria
termfila Thermus aquaticus que habita en
medios de muy alta temperatura (50-80 C),
elimin los grandes inconvenientes del mtodo de
la PCR. Esta polimerasa es estable a altas
temperaturas,
permaneciendo
activa
hasta
despus de la desnaturalizacin del ADN

Buffer de reaccin: Cloruro de

magnesio
Acta como cofactor de la ADN polimerasa. La
concentracin se debe optimizar.
Exceso de magnesio produce una amplificacin
inespecfica de productos de PCR.
Una baja concentracin disminuye la produccin
del amplificado.

Buffer de reaccin: dNTPs

Para que la polimerasa lleve acabo su funcin necesita
desoxinucletidos en la mezcla de reaccin para
sintetizar la nueva hebra de ADN. Deben adicionarse en
una concentracin ptima.
Cantidades mayores de 200 M pueden producir
incorporaciones errneas
Concentraciones menores de 50 M se consideran
insuficientes para una sntesis adecuada.

Buffer de reaccin: Amortiguador

La solucin amortiguadora proporciona el pH
y concentracin de sales adecuadas para la
correcta funcin de la ADN polimerasa, esta
compuesto por Tris-HCl y KCl.

Pasos PCR
La PCR convencional consta de cinco
pasos de temperatura:

Desnaturalizacin
Alineamiento
Elongacin
Elongacin final
Mantenimiento

Desnaturalizacin
Es necesaria una temperatura de 95 C
para la desnaturalizacin de la doble
cadena de ADN

Alineamiento
La temperatura baja a un rango entre
50-65 C, con el fin de que los primers
hibriden en la cadena molde

Elongacin
Se eleva la temperatura a 72 C para el
ptimo funcionamiento de la Taq
Polimerasa

Elongacin final
La temperatura de extensin a 72 C se
mantiene por 6 minutos para que termine la
extensin de los productos incompletos.

Mantenimiento
Se programa un ciclo final de 15 C por
varias horas, lo que permite conservar los
productos de PCR hasta que se retiren los
tubos de reaccin del equipo.

Recomendaciones para una PCR

Contar con un ADN de buena calidad

Correcto diseo de primers
Determinar programas de PCR
Trabajar de manera limpia y ordenada

Tipos de PCR
Convencional: Se basa en la deteccin
del producto de amplificacin.
La intensidad de la banda se considera
proporcional a la cantidad del producto
amplificado y su longitud se verifica con
un marcador de peso molecular.

Tipos de PCR
Cualitativa:
Permite
detectar
la
presencia o ausencia de un fragmento
de ADN determinado.

Tipos de PCR
Mltiple: Se realiza la amplificacin de
ms de un fragmento de ADN en una
sola reaccin de PCR con dos o ms
juegos de primers, se utiliza para la
deteccin simultnea de varios agentes
patgenos, ogms, etc.

Tipos de PCR
Anidada: Proporciona mayor sensibilidad a la
tcnica de PCR convencional, al amplificar las
secuencias de ADN en dos rondas de
amplificacin con distintos pares de iniciadores.
Primero se realiza una PCR convencional con
primers externos a la regin que se desea
amplificar. Se disean primers internos para
amplificar una regin ms pequea.

Tipos de PCR
PCR tiempo real: la deteccin de copias del
producto de PCR se realiza al mismo tiempo que
sucede la amplificacin. Los primers con
fluorocromos
permiten
deteccin
de
fluorescencia liberada durante la reaccin por lo
que se puede medir la cantidad de ADN
sintetizado en cada momento

PRCTICA DE
LABORATORIO

Gen 16S

Mezcla de reaccin
Amplificacin de gen ribosomal 16 S LSU de bacteria
Reactivo
Buffer de reaccin
Primer F
Primer R
Taq Polimerasa (MyTaq
Bioline)
ADN
H2O MQ
Volumen final

1 reaccin
4 L
0.4 L
0.4 L
0.2 L
2 L
13 L
20 L

Programa de
amplificacin
Paso
Desnaturalizaci
n inicial
Desnaturalizaci
n
Alineamiento
Elongacin
ADN
Mantenimiento

Temperatura
95 C/ 2 min

Ciclos
1

94 C/ 1 min
55 C/ 1 min
72 C/ 2 min
72 C/ 6 min
15 C

35
1
1

GRACIAS POR SU
ATENCIN