LIZMETH

CALDERN
JHANNON
LOZANO
STEVEN
CANTILLO
DAVID SILVA

VECTORES DE CLONACIN
Un
vector
es
un
agente
(microorganismo) que transporta un
patgeno a otro organismo vivo. En
gentica, es un agente que transfiere
informacin gentica, por algn tipo de
medio, de un organismo a otro. Un
vector con el que los cientficos
experimentan son los plsmidos.

PLSMIDOS

Los plsmidos son molculas de ADN de doble cadena que se

encuentran en varias especies de bacterias. Estos elementos gnicos
son extracromosomales y pueden codificar para una gran variedad de
enzimas que pueden conferir a alguna ventaja al organismo que las
posee.
1957 Durante una epidemia
de disentera en Japn, un
grupo de bilogos descubri
que ciertas cepas de bacterias
eran resistentes a antibiticos.
Posteriormente se descubrira
que esta resistencia se deba
a plsmidos.

PLSMIDOS: FUNCIN
Los vectores plasmdicos son utilizados generalmente para la
clonacin del ADN. Esta tcnica consiste principalmente en
introducir una secuencia de ADN en un virus o bacteria, y sigue
los siguientes pasos:
1) el aislamiento inicial o sntesis del fragmento de DNA de
inters.
2) el acoplamiento de esta secuencia a un vehculo o vector
portador.
3) la incorporacin del complejo vector-DNA en la clula
hospedadora.
4) la expresin del DNA en la clula hospedadora.

PREPARACIN DEL ADN

El genoma humano contiene unos 3 000 millones de
pares de bases, por lo que localizar una secuencia que
codifique para una protena determinada, por
ejemplo, la insulina es sumamente difcil. Para lograr
una produccin de una protena concreta en un
sistema bacteriano, es necesario incorporar a ste la
secuencia definitiva del RNAm en forma de secuencia
de DNA, a partir de la cual la bacteria seria capaz de
transcribir el mensajero adecuado e incluso traducirlo
en la protena correspondiente.

PREPARACIN DEL ADN

Supongamos que nos interesa aislar el gen
que codifica la insulina humana de modo que
pueda sintetizarse in vitro. El gen de la
insulina constituye unos cuantos nucletidos
de los 3000 millones de pares de bases que
contiene el genoma humano. Entonces, para
aislar el gen de la insulina, primero debe
fragmentar las grandes molculas de ADN.

PREPARACIN DEL ADN

La enzimas reconocen secuencias especficas (sitios
de restriccin) de cuatro a ocho nucletidos y
efectan cortes en sitios especficos sobre ambas
cadenas dplex. separando al DNAc del RNAm
original, el cual es digerido, y procediendo a la
sntesis de la segunda cadena mediante una enzima
polimerasa de DNA, con lo que se obtiene un DNAc de
doble cadena representativo de los RNAm originales,
el cual puede ser incorporado al sistema bacteriano
mediante su insercin en un vector adecuado.

Formacin del plsmido o complejo

de DNA vector-insertos

Una vez producido el DNA a clonar, es

necesario incorporarlo a un sistema en
el cual pueda ser expresado. Esto
implica la insercin del fragmento en
cuestin en un vector, para lo cual es
indispensable la elaboracin de un mapa
de restriccin, que permita localizar el
nmero y la posicin de los sitios de
corte de las endonucleasas que se
utilizarn.

A fin de lograr la clonacin o insercin

del fragmento de DNA de inters en el
vector correspondiente, utilizamos una o
varias enzimas de restriccin. Una forma
de hacerlo es identificando primero una
secuencia nica de corte en el vector,
que permita abrirlo para insertar
despus el fragmento correspondiente
mediante una ligasa de DNA.

CLONACION DEL ADN EUCARIOTA EN

PLSMIDOS BACTERIANOS
El DNA extrao que debe clonarse se introduce en el
plsmido para formar una molcula de DNA recombinante.
las clulas bacterianas pueden captar DNA de su medio. Este
fenmeno, conocido como transformacin, constituye la
base para la clonacin de plsmidos en clulas bacterianas.
En este procedimiento, a un cultivo bacteriano pretratado
con iones calcio se aaden plsmidos recombinantes, cada
uno con diferente DNA extrao. Cuando estas bacterias se
someten a un breve choque de calor, se estimulan para
captar DNA de su medio.

CLONACION DEL ADN EUCARIOTA EN

PLSMIDOS BACTERIANOS

Una vez captado, el plsmido se

duplica de manera autnoma
dentro de la clula receptora
pasando a su progenie durante la
divisin celular. Despus de
alcanzar
la
cantidad
de
amplificacin
deseada,
se
cosechan las clulas, se extrae el
DNA y el plsmido de DNA
recombinante se puede separar
con facilidad del cromosoma
bacteriano. A continuacin, el
DNA clonado se puede separar
del plsmido.

Expresin del ADN clonado en un

sistema bacteriano.
Para lograr que el DNA clonado se exprese en un sistema
bacteriano, es necesario tomar en cuenta ciertos aspectos
adicionales.
1) El DNA a expresar debe ser clonado en un plsmido (vector)
reconocible por la enzima encargada de la produccin de RNAm
mediante la transcripcin.
2) La eficiencia del proceso de expresin depender de varios
factores: el nmero de copias de plsmido por clula, la efi
ciencia del promotor, el ndice de frecuencia de uso de codones,
la estabilidad o vida media del RNAm, as como el nivel de
protelisis de la clula hospedadora.

VENTAJAS
Poseen un origen de replicacin que permite realizar mltiples
copias en una misma clula (100 a 200 copias por clula).
Resistencia a ampicilina, mediante la produccin de la enzima
betalactamasa que inactiva por protelisis a la penicilina.
Mediante plsmidos con doble marcador de resistencia (pBR322),
el sitio de insercin del inserto elimina la resistencia a
tetraciclina. Los transformantes con insertos son resistentes a
ampicilina, pero sensibles a tetraciclina, en tanto que los
transformantes sin inserto son resistentes a ambos antibiticos.
Incluyen sitios de restriccin nicos y son diseados con sitios de
clonaje mltiple (Polylinker), lo cual incrementa la flexibilidad en
trminos de la seleccin de la o las enzimas de restriccin
utilizadas para el clonaje (pBluescript o pUC18).

VENTAJAS
Diseados con un promotor especfico en ambos extremos del
sitio de insercin o clonaje, lo cual permite la transcripcin del
inserto en ambas direcciones.
Diseados con orgenes de replicacin de bacterifagos para la
produccin de DNA de cadena sencilla en ambos extremos del
sitio de insercin o clonaje, el cual puede ser utilizado para
secuenciacin.
Resistencia a kanamicina, mediante la produccin de una
fosfotransferasa que fosforila a la kanamicina impidiendo su
unin al ribosoma.

DESVENTAJAS
Permiten el clonaje nicamente de fragmentos pequeos.
Insertos de 4 a 5 kb en promedio con un mximo de
aproximadamente 15 kb.
VECTOR

TAMAO PROMEDIO DEL

INSERTO

Plsmido

4-5 kb

Lambda

15-20 kb

Csmido

40-45 kb

YAC

400 kb