BIOTECNOLOGA

MDICA
FASE I
Biotecnologa Mdica 2016 Ing.
Betty Salazar Pinto
bettysalazar2211@gmail.com

EL LABORATORIO DE DIAGNSTICO GENTICO

MOLECULAR

BUENAS PRCTICAS DE LABORATORIO

(BPL)

REGLAS
PRCTICAS

FDA,
FDA, OECD
OECD

PROCEDIMIENTOS

ASEGURAR LA CALIDAD E
INTEGRIDAD DE LOS DATOS
PRODUCIDOS EN ESTUDIOS O
INVESTIGACIONES.

 CONFIABLES: precisin y rplicas.

REPRODUCIBLES
AUDITABLES: documentacin.
RECONOCIDOS POR EL MUNDO
CIENTFICO: publicaciones

RECURSOS
REGLAS
CARACTERIZACIN
DOCUMENTACIN
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

EDIFICACIN

reas separadas.
Vestuario.
Descontaminacin.
Aire acondicionado.
Corriente estabilizada.

EQUIPAMIENTO

Extraccin de cidos
nucleicos.
Electroforesis.
PCR.

MUESTRAS
Sangre
Sangre Total
Total
Cabellos
Cabellos
Clulas
Clulas Bucales
Bucales
Biopsias
Biopsias In
In vivo
vivo
Biopsias
Biopsias en
en parafina
parafina
Orina
Orina
Heces
Heces
Esputo
Esputo
Aspirado
Aspirado Bronqueal
Bronqueal
Y
Y otros
otros fluidos
fluidos corporales.
corporales.

EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS

ADN
PENTOSA: Desoxirribosa.
BASES NITROGENADAS:
adenina y timina.
GRUPO
FOSFATO:
hidrosolubilidad.

citosina,

carga

guanina,

negativa

ENLACE PUENTE DE HIDRGENO: Entre bases

nitrogenadas.
ENLACE FOSFODISTER: Entre pentosa y grupo
fosfato.

ARN
PENTOSA: Ribosa.
BASES NITROGENADAS.
GRUPO FOSFATO.
ENLACE PUENTE DE HIDRGENO.
ENLACE FOSFODISTER.

EXTRACCIN

CLULAS
CLULAS
NUCLEADAS
NUCLEADAS

SEPARACIN DE
GLBULOS ROJOS
Y GLBULOS
BLANCOS.

TEJIDOS
TEJIDOS

FIJADOS O
DESPARAFINADOS:
FORMALINA 10 %
DESPARAFINAR:
XILENO

FICOLL

MICROORGANISMOS
MICROORGANISMOS

LISIS DE LA PARED
CELULAR.
M.
M.
M.
M.

ENZIMTICO.
QUMICO.
MECNICO.
MIXTO.

MTODOS

FENOLCLOROFORMO

Fase acuosa: ADN

Restos celulares o debris
Fase orgnica:
lpidos y protenas

FASE SLIDA:
SLICA

LISIS CELULAR
ELIMINACIN DE PROTENAS
PRECIPITACIN DEL CIDO NUCLEICO
PURIFICACIN DEL AN.
PUREZA Y CONCENTRACIN

REACTIVOS

Lisis eritrocitos: EDTA,

Lisis leucicitos: SDS, Tris, EDTA
Cloroformo: formacin de fases
Fenol y alcohol isoamlico: evita la formacin de espuma.
Isopropanol y etanol: precipitacin
Etanol: purificacin

DETECCIN Y RESOLUCIN DE CIDOS

NUCLEICOS

ELECTROFORESIS

Consiste en el movimiento de
molculas a travs de una matriz
por la aplicacin de corriente
elctrica.

Peine.
Gel de agarosa o poliacrilamida.
Cmara electrofortica.
Electrodos .
Buffer.
Colorantes.

Concentracin del gel: agarosa y

poliacrilamida.
Variantes: PFGE

ESPECTROFOTOMETRA

Consiste en la transmisin de la luz a

travs de una solucin, para
determinar la concentracin de un
soluto presente en la misma.
LEY DE LAMBERT - BEER
ABSORBANCIAS:
230: compuestos orgnicos.
260: AN.
270: Fenol.
280: protenas.
CONCENTRACIN:
ADN: 50 g/ mL = 1 DO
ADN: 1Mm = 6,7 DO.
ARN: 40 g/ mL = 1 DO

PUREZA

DNA
260/280 <1.8
Inaceptable

RNA
260/280 <2
Inaceptable

DNA
260/280 >1.8
Aceptable

RNA
260/280 >2
Aceptable

FLUOROMETRA

Fluorforos:
DABA, HOECHST,
PICOGREEN,
OLIGREEN.

Tecnologa Labon-a-chip.
Consta de
microcanales
Sistema
automtico,
mnimos
volmenes y
anlisis
simultneo de
muestras.

MICROFLUIDOS
MICROFLUIDOS

Se basa en la
fluorescencia que
es proporcional a
la concentracin.

Se basa en la
electroforesis y
la matriz se
introduce en un
chip.

CARACTERIZACIN DE CIDOS NUCLEICOS

TIPO
TIPO DE
DE ESCISIN
ESCISIN
EN
EN POSICIN
POSICIN
TERMINAL
TERMINAL O
O
INTERNA
INTERNA

NUCLEASAS

TIPO
TIPO DE
DE ENLACE
ENLACE
FOSFODISTER
FOSFODISTER

TIPO
TIPO DE
DE PENTOSA
PENTOSA Y
Y
BASE
BASE NITROGENADA
NITROGENADA

Revisar los tipos de endonucleasas!!! (tipo I, II y III)

Endonucleasa
exonucleasa

Tipo a: OH 3
Tipo b: OH 5

DNAsas
RNAsas

Se llaman adems de nucleasas de restriccin, endonucleasas de

restriccin, enzimas de restriccin o restrictasas.

Se nombran con tres letras del gnero y especie y un nmero

romano, HaeIII

Sus sitios de reconocimiento se presentan en el ADN dplex y la

hidrlisis se da nivel del enlace fosfodister.

Mecanismo de metilacin, impide la unin de la enzima de

restriccin

HIBRIDACIN

DESNATURALIZACN
Rotura de los puentes de hidrgeno entre pares de
bases.

Temperatura

cidos y bases

Agentes
qumicos

REA,
FORMAMIDA Y
FORMALDEHDO

DNA CON
SECUENCIA
DIANA

SONDA
MARCADA

HIBRIDACIN

MTODOS
En fase
lquida
En soporte
slido

In situ.

HIBRIDACIN EN SOPORTE SLIDO

DOT-BLOT Y SLOT-BLOT
SOUTHERN BLOT
NORTHERN BLOT
WESTERN BLOT

MICROARRAYS
Fragmentos de cidos nucleicos
Oligonucletidos

MATRIZ

AMPLIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS:

PCR

DEFINICIN

REQUERIMIENTOS

Amplificacin directa de una

regin especfica (fragmento de
ADN o cADN) para obtener
mltiples copias en corto tiempo.

ADN diana.
dNTPs.
MgCl2.
Primers.
Enzima: ADN polimerasa

ETAPAS DEL CICLO

Desnaturalizacin

92 98 C.

Hibridacin

50 - 65 C.
Enfriamiento por
debajo de la Tm.

Elongacin

70 75 C.
La ADN polimerasa
aade los dNTPs al
extremo 3 del primer.

VARIANTES

qPCR

RT-PCR

Mide la velocidad a la que se amplifica.

Amplifica y cuantifica
simultneamente.
Requiere de un termociclador capaz de
incidir un haz de luz en la muestra y
detectar la fluorescencia emitida.
Necesita una sonsa con un colorante.
Sondas TagMan y Sybr Green.
Utiliza dos enzimas: transcriptasa
reversa y ADN polimerasa.
Trabaja con fragmentos ARN.
Amplifica fragmentos de cDNA.

PCR larga

PCR
anidada

PCR
asimtrica

PCR
adaptadores

PCR
multiplex

Regiones diana de gran tamao (40 Kb).

Se aade otra enzima.

Usa cuatro primers.

Se dan dos reacciones de PCR.

Se aaden cantidades muy diferentes

de ambos primers.

Cuando se trabaja con regiones de

secuencia desconocida.

Diferentes fragmentos.
Diferentes tipos de cebadores.

SECUENCIACIN DE CIDOS NUCLEICOS

Gilbert (1977): mtodo qumico.

Sanger (1980): mtodo enzimtico.

Determinacin de la secuencia de
nucletidos de una molcula especfica.
Es fundamental para hacer predicciones subre
su funcin.

 Se someten a cuatro tratamientos

diferentes, se marcan radiactivamente.
Se realiza una electroforesis. Cada
mancha indica la posicin de la bases
nitrogenadas.
Se generan fragmentos de ADN de hebra
sencilla.

MTODO QUMICO DE MAXAM Y

GILBERT
Marcaje del DNA: extremo 5
Hidrlisis selectiva qumica
Separacin de los fragmentos
Anlisis de los productos
Se aplica a secuencias de ADN menores a 250 ncletidos.

Enlace N-glicosdico

Enlace fosfodister

ELIMINACIN:
Guanina: DMS y formiato
amnico.
Guanina y adenina: cido
frmico.
Citosina: hidroxilamina.
Citosina y timina:
permanganato de sodio.

MTODO ENZIMTICO DE SANGER

Sntesis de un DNA
complementario: ADN polimerasa
Interrupcin de la elongacin:
ddNTPs (falta de 3 OH)
Separacin de los fragmentos
Anlisis de los productos

La enzima aade los dNTPs siempre desde el extremo 3 del primer

VARIANTE DEL MTODO:

PIROSECUENCIACIN
Monitoreo a tiempo real de la sntesis
de ADN.

La reaccin de polimerizacin del ADN

a partir de sus dNTPs libera PPi.
Se genera luminiscencia cuando se
aaden los nucletidos a la cadena de
ADN.

Con ste mtodo no hay geles, colorantes fluorescentes o ddNTPs.

Adicin de
dNTPs

Liberacin de
PPi

ADN + dNTPs

Formacin del
enlace
fosfosister
entre el dNTP y
el primer.

Conversin de
PPi a ATP

Sulfurilasa
(APS + PPi = ATP)

Generacin
de
luminiscencia
por ATP

Luciferasa:
Luciferina a
oxiluciferina
(ATP = luz)

Si el dNTP que ha sido aadido al medio de

reaccin no es el complementario al que ocupa la
posicin que toca copiar, ste es degradado por una
enzima llamada apirasa antes de que se aada el
siguiente dNTP.

PROYECTO
GENOMA
HUMANO

A mediados de los aos 1980 se concibi el Proyecto Genoma Humano.

El proyecto se inici en 1990 y se planteo con una duracin de 15 aos, pero

los avances tecnolgicos permitieron culminarlo en poco ms de 10.

Aprox. 3 x 109 pb del genoma humano en 11 aos.

An no se sabe con certeza los genes que tenemos. El conocimiento de la

secuencia no implica el conocimiento de zonas codificantes.

El proyecto Genoma Humano no es un fin en s, sino una va para conocer y

entender la vida en nuestro planeta

Secuenciaci
n

Amplificacin de los fragmentos de ADN

Escisin del DNA con enzimas de
restriccin.
Obtencin de ADN.

EJERCICIOS

5
G
A
T
T
T
A
A
A
G
C
G
C
G
T
A
T
T
A
3

5
G
A
C
A
G
A
T
A
C
A
G
A
T
T
T
T
A
A
3

T
3
A
T
G
G
G
A
T
G
G
A
C
G
C
5

5
T
A
C
C
C
T
A
C
C
T
G
C
G
3

3
G
T
A
G
A
C
A
T
A
G
G
A
C
A
T
A
T
G
5

 Ud. ha purificado el DNA de una plsmido a partir de un pequeo

cultivo. El ADN lo suspendi en un volumen de 65 L. Ha diluido 30
L de la muestra en un volumen final de 1 mL de agua estril.
Luego midi las absorbancias de la muestra a 260 y 280 nm
obteniendo las siguientes lecturas: A260 = 0.603 y A280 = 0.398.
Hallar:
a. La concentracin de ADN en los 65 L de la preparacin del
plsmido.
b. La cantidad total de ADN que se purific siguiendo el protocolo de
preparacin del plsmido.
c. La pureza.

 Una solucin de ADN tiene un valor de A260 = 0.564. Cul es la

concentracin en ng de ADN/mL.
Una solucin de ADN tiene una absorbancia a 260 nm de 0.756.
determinar su concentracin expresada en milimolaridad.
. Un stock de ADN tiene una concentracin de 397.65 g/mL Cul
ser la concentracin en pmol de ADN/L.