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I. Cultivo Celular
II. Anlisis Cromosmico
CULTIVO CELULAR
Los cultivos celulares son un
procedimiento tecnolgico de
mantenimiento y estudio de
clulas vivas en un medio
artificial que permite reproducir,
de manera bastante fiable, las
condiciones biolgicas que las
clulas tienen en su lugar de
origen.
Potencialmente todas las clulas
son cultivables, pero cada una de
ellas presenta peculiaridades y
requerimientos especficos.
MEDIO DE
CULTIVO BASE
MEDIO DE
CULTIVO
ESPECIFICO
SANGRE
PERIFERICA
RPMI 1640, Mc
CoyS Modified, Tc
199
PB Max Karyotiping
Medium, Createst
Lynfocitos
MEDULA OSEA
Marrou Max
Karyotiping
Medium
LIQUIDO AMNIOTICO
AMNIOMAX, Chang
B+C
RESTOS
ENDOUTERINOS
AMNIOMAX, Chang
B+C
PIEL
RPMI 1650
Chang B+C
Formas de
presentacin
diferentes.
. Medio Lquido y
en
polvo
. Microcultivo
TECNICAS DE
ESTUDIO
CITOGENETICO
Algo de historia
J.H.Tjio
(1956)
Lejeune
(1966)
Pateau
(1961)
Tcnica Convencional
Cariotipo humano: 46 XY
DNA
replication
metaphase
chromosomes
condense
nuclear
envelope
breaks
down
chromosomes
alignedon
spindlefibers
Cultivo Celular
Siembra
Cosecha
Preparacin de laminas
RPMI-1640 es un medio de
cultivo que fue desarrollado
por Moore et al. en el Roswell
Park Memorial Institute, de
ah el acrnimo RPMI. Este
medio contiene una gran
cantidad de fosfato y est
formulado para su uso en una
atmsfera de dixido de
carbono 5%.
COSECHA
1. Colchicinizacin
. Agregar Colchicina
0.1 ugr/ml : 50 100
ul.
. Mezclar suavemente
. Incubar
El colcemid es un anlogo de
la colchicina que
despolimeriza los
microtbulos del
citoesquelto, impidiendo la
formacin del huso mittico, y
por lo tanto bloqueando la
mitosis en la etapa de
metafase
Por su unin
reversible con la
tubulina
citoplasmtica
impide su
polimerizacin
dentro de los
microtbulos
celulares, quedando
inhibida la metafase
de la divisin celular.
sobrenadante.
. Trabajar siempre con el sedimento
. Adicionar 5 ml de
fijador
. Mezclar con pipeta
pasteur
. Dejar a TA por 20
minutos
o dejar en refrigeracin
a
+ 4C por das a
semanas.
. Centrifugar
ANALISIS CROMOSOMICO
Cultivo Celular
B. Cultivo Celular Directo:
1.- Cultivo de Lquido Orgnico:
.- No se hace un cultivo celular propiamente dicho
.- Se realiza directamente un choque hipotnico de
las clulas y posterior fijacin.
.- Permite demostrar alteraciones cromosmicas
numricas y/o estructurales que indican la
presencia de clulas neoplsicas.
2.- Cultivo de Mdula Osea:
.- Cultivo a corto plazo (24-48-72 horas)
.- Muestra: Aspirado de Mdula Osea
.- Realizado para el estudio cromosomico en
pacientes con
desordenes mieloproliferativos (Sndromes
Mielodisplsicos,
Leucemias)
Criterios de Malignidad
1. Alteraciones Numricas (ploida)
Hipodiploida : N Cr < 46
Hiperdiploida : 69 > N Cr > 46
Poliploida :
N Cr > 69
CULTIVO
MEDULA
OSEA
Cultivo Celular
3.- Cultivo de Piel
.- Cultivo largo plazo (14-21 das)
.- Muestra: Biopsia de piel (Cultivo de fibroblastos)
.- Realizado generalmente cuando se sospecha de un
mosaicismo cromosmico no detectado en Cultivo de
Linfocitos.
4.- Cultivo de Tumores:
.- Cultivo largo plazo (14-30 das)
.- Muestra: Biopsia del tumor la pieza quirrgica del
tumor
.- Realizado para demostrar la presencia de una
alteracin numrica y/o estructural de los cromosomas
que estn asociados a la presencia de clulas tumorales
clulas neoplsicas.
.- Brindan informacin sobre el diagnstico, estadiaje,
pronstico y evaluacin del tratamiento de los tumores.
Cultivo Celular
5.- Cultivo de Clulas Fetales
.- Cultivo a largo plazo (10-14 das)
.- Muestra: Liquido Amnitico obtenido por Amniocentesis
alrededor
de la 16 semana de gestacin.
.- Se efecta para hacer el diagnstico prenatal de una alteracin
cromosmica.
6.- Cultivo de Vellosidades Coriales:
.- Cultivo corto plazo (24 48 horas) y Cultivo largo plazo (10-14
dias)
.- Muestra: Biopsia aspiracin de Vellosidades Corinicas
alrededor de la 10 semana de gestacin.
.- Se efecta para hacer el diagnstico prenatal de una alteracin
cromosmica.
7.- Cultivo de Restos Endouterinos:
.- Cultivo largo plazo (10-14 das)
.- Muestra: Legrado uterino y/o producto abortado
.- Se realiza para detectar una anomala cromosmica del
producto.
Amniocentesis
Cultivo de Vellosidades
Coriales
Cultivo de vellosidades
coriales
Biopsia transcervical
Biopsia transabdominal
MUCHAS GRACIAS
herrerahh7@yahoo.es
BANDEO CROMOSOMICO
Existen varias tcnicas de
bandeo cromosmico, que nos
permiten identificar individualmente
los cromosomas, lo cual facilita la
identificacin de una alteracin
cromosmica
numrica
y
especialmente
demostrar
la
presencia
de
alteraciones
cromosmicas estructurales.
BANDAS CROMOSMICAS
Los bandeos cromosmicos pueden
clasificarse en morfolgicos y dinmicos:
de bandas Q
de bandas G
de bandas R
de bandas C
Tcnica de bandas Q
Fue la primera metodologa de bandeo
cromosmico ( llamado as por la
sustancia fluorescente empleada la
quinacrina)
1970, Casperson y colaboradores la
desarrollaron.
1971 - (Conferencia en Paris) fue
denominada como la tcnica de banda Q.
UTILIDAD
Demostrar la porcin distal del brazo largo del
cromosoma Y que se tie con mas intensidad que
los dems cromosomas.
Las
regiones
pericentromricas
de
los
cromosomas 3 y 4 , y las regiones satelitales y
pericentromricas
de los cromosomas
acrocntricos muestran variaciones significativas
conocidos como polimorfismo o heteromorfismos
demostrados con estas tcnicas.
La fluorescencia mayor depende del ADN, si la
regin es mas rica en adenosina y timina (A-T)
habr mayor fluorescencia, pero si es el ADN rico
en (G-C) la fluorescencia tiende a apagarse.
DESVENTAJA
Es el uso de la fluorescencia , que
despus de que es usada desaparece
progresivamente y es por ello que la
observacin, el anlisis cromosmico as
como la toma de microfotografa debe ser
rpida
para
su
observacin
en
el
microscopio.
SOLUCIONES:
1.
2.
Buffer Sorensens a
pH 5.6
Colorante
Dihidrocloruro de
Quinacrina al 1%
PROCEDIMIENTO :
1.
Bandeo Q (quinacrina)
Tecnica de bandas G
La tcnica de bandas G ( Giemsa )
obtenidas por digestin proteoltica con
el uso de la enzima tripsina, es la mas
usada y considerada como una tcnica
estndar.
Es una tcnica conocida como GTG
(Bandas G por tripsina usando Giemsa),
es un mecanismo aun no aclarado.
Tecnica de
bandas G
Clark y Coleg.
Histonas ricas
en Arginina
En las bandas GTG
No tanto con la
perdida de
ADN y proteina de
cromosomas durante
el tx con tripsina
Dos tipos de
bandas
Bandas G +
(oscuras)
Relativamente
ricas en prot.
Disulfuro
Bandas G (claras))
Sulfihidrilos
SOLUCION :
1.
2.
3.
Solucin de trIpsina al 1%
Solucin salina fisiolgica
Colorante Giemsa 4%
PROCEDIMIENTO :
1.
2.
3.
4.
5.
. Bandeo GTG:
- Tripsina 1%
(buffer)
- Solucin Salina
Fisiolog.
- Giemsa 4%
bandas G-plidas
bandas G-oscuras
DNA rico en GC
DNA rico en AT
replicacin temprana
replicacin tarda
Muchos genes
Pocos genes
Esta imagen
muestra cada
cromosoma
humano normal
comparado con
su idiograma, o
mapa, de
bandas G, un
esquema
acordado
internacionalm
ente para los
patrones de
bandas.
Tcnica de bandas R
Se hace el tratamiento de las laminas a
altas temperaturas en varios buffer
Tincin con Acridina Oramge o Giemsa
Las bandas que producen estas tcnica en
los cromosomas humanos son el reverso
de bandas G o Q es decir que las bandas
claras en Q o G son bandas oscuras en R.
VENTAJAS
Que la regiones telomricas
de los
cromosomas son mas
teidas, a
diferencia de las tcnicas de bandas Q y
G en las que no son tan claras.
El
tratamiento
con calor
induce
denaturacin
de las protenas
cromosmicas
as
como
de
las
secuencias
del
ADN
ricas
en
nucletidos(A-T), mientras que el ADN
rico en G-C de las bandas R en una
configuracin nativa.
SOLUCION:
1.
2.
Buffer
sorensens(0.06,pH6.59)
Colorante de Giemsa.
PROCEDIMIENTO :
1.
2.
3.
4.
5.
Preparar el buffer
sorensens en un koplins
y llevar a bao Maria
85C
Colocar las lminas
preparadas(1-2 sem) en
el buffer sorensens
durante 10.
Lavar las laminas de
buffer S.
Colocar en colorante de
Giemsa por 5.
Lavar, dejar secar y
observar al microscopio
Bandas R
-til para teir
los extremos
distles de los
cromosomas
(deleciones o
reorganizaciones
distales)
R
Alto
temprana
Sines (alu)
Abundantes
Abundantes
Domsticos
Tecnica de bandas C
La tcnica de bandas C produce una
tincin selectiva de la heterocromatina
constitutiva
,estas
bandas
estn
localizadas
en
la
regin
pericentromrica de los cromosomas
humanos.
1971- Fue un mtodo descrito por Arrighi
y Hsu.
APLICACION
Demuestra variacin de tamao de la regin
de heterocromatina constitutiva presente en
las
regiones
pericentromricas de los
cromosomas.
Para los cromosomas 1,9,16 y brazos largos
del cromosoma Y.
Polimorfismos.
Inversiones pericentromricas.
Tecnica de
bandas C
Desnaturalizar
Extraer el material
cromosmico
Incubado en
solucin salina
GIEMSA
Alcali
SOLUCION :
HCL 0.2N
Ba (OH)2 5%
Solucin saluria de
citrato de
sodio(2xSSC)
Giemsa
PROCEDIMIENTO :
Bandeo C tie
especficamente
regiones centromricas
MUCHAS GRACIAS
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