Lima, UIGV, Junio 2013

Qumica de los Flavonoides,

Aislamiento y caracterizacin de
Isoflavonas y su Actividad
Biolgica

Q.F Heinz Jungbluth

Ganoza

Introduccin
Pigmentos
naturales
con
una
estructura carbonada C3-C6-C3 o
mas, especficamente con un grupo
fenilbenzopirano, dependiendo de la
unin del grupo aromtico con el
ncleo benzopirano (cromano) sern,
flavonoides
2-fenilbenzopirano,
isoflavonoides
3-benzopirano,
neoflavonoides 4-benzopirano

2-fenil Benzopirano

Isoflavonoides

Neoflavonoides

Flavonoides Minoritarios

Botnica

Isoflavonas
Distribucin: Las Isoflavonas se hayan
presentes mayoritariamente en la familia de
las
leguminosas
(Fabaceae)
,
preferentemente
en
la
subfamilia
papilionideae, existen grandes revisiones de
investigaciones sobre la presencia de
Isoflavonas en esta subfamilia como la de
Veitch (2007, 2009). Se encuentran presentes
en los frutos de esta familia (Legumbre) y en
las races o rizomas (mecanismo de fijacion
de Nitrogeno)

Qumica

Isoflavonas
Caractersticas qumicas resaltantes:
Las isoflavonas difieren de sus
respectivos
flavonoides
por
la
migracin de un anillo aromtico de
C2 a C3. Mayores cambios en la
estructura
dependern
de
su
Hidroxilacion,
metoxilacion,
o
metilendioxisustitucion, prenilacion y
Glicosilacion.

Isoflavonas

Biosntesis

Biosntesis
Las Isoflavonas proceden de la
ruta de los Fenilpropanoides,
pero el paso crucial para
convertirse en Isoflavonas esta
en
la
conversin
de
la
respectiva flavanona en una
Isoflavona, la enzima que
realiza este proceso es la 2hidroxiisoflavanona
sintetasa
(2HIS) luego se produce una
dehidratacin mediante la 2hidroxiisoflavona
dehidrasa
convirtindola
en
una
Isoflavona(
todas
estas
enzimas
ya
han
sido
caracterizadas
convenientemente)

Biosntesis
Regulacin:
La va del cido shikmico es dependiente de la luz.
La accin de la fenilalanina amonioliasa, que inicia la va biosinttica
de los flavonoides, es fundamental para la vida de las plantas y por
ello est estrictamente regulada. Entre otros factores, la fenilalanina
amonioliasa es activada por la luz, y depende adems de la
concentracin de diferentes hormonas vegetales. La actividad de la
fenilalanina amonioliasa suele aumentar cuando a los vegetales se les
somete a situaciones de estrs, como puede ser la falta de agua
("estrs hdrico"), infecciones fngicas o bacterianas, radiaciones UV,
y el fro (por esto ltimo las plantas sometidas a bajas temperaturas
suelen presentar coloraciones rojizas en tallos y hojas, y cuando los
inviernos son muy fros, las flores desarrollan colores muy intensos en
la primavera siguiente).
Hay isozimas dedicadas a la produccin de flavonoides diferentes en
respuesta a seales ambientales diferentes

Fitoqumica

SECUENCIA DE
INVESTIGACION

OBTENCION DEL
MATERIAL

IDENTIFICACION

DESECACION

Colectar planta completa,- Por un botnico de

- Para eliminar H2O y
experiencia
flor y fruto.
evitar alteracin.
Buen
manejo
de
literatura
- Por duplicado.
- Hacerle gradualmente-Guardar
muestra
- Anotar nombre vernculo
cambios de lugares.
herborizada
y cientfico.
- Aire libre, en el sol
- Hbitat, tamao, aspecto y
sobre papel que se cambia
color de los rganos
diariamente.
recogidos
- Estufa: temperatura
- Clima, altitud, abundancia
controlada+ aire forzado
o escasez de la especie.
- Una foto.

Obtencin
del material
vegetal

PROCESO DE INVESTIGACION FITOQUIMICA

Desecacin
y
conservaci
n
(estabilizaci
n)
Identificaci
n
taxonmica
y sus partes

Tamizaje
fitoquimico

Extraccion P.
activos

Formulacin

Aislamiento
y
caracterizaci
n del P. A

Aislamiento
Existen muchas vias de aislar y
separar una isoflavonas, lo mas
importante es reconocer el material
del cual se esta extrayendo (material
vegetal, muestra biolgica,
Alimento), la presencia de
carbohidratos y compuestos
lipofilicos, afectara el desarrollo del
metodo.

Aislamiento
SPE: (Solid Phase Extraction): Para
poder evitar la mayor cantidad de
interrupciones en la matriz, como
medio de purificacin podemos
utilizar cartuchos de SPE C1;
eluyendo el extracto en el cartucho y
luego pasando a travs del mismo
MeOH con pequeas concentraciones
de Acido actico.

Aislamiento
Partiendo de una muestra vegetal:
La utilizacin de Material Seco,
podra hacer decrecer la presencia
de Isoflavonas, de preferencia utilizar
material
fresco.
Flavonoides
altamente acilados suelen ser lbiles
a
temperaturas
muy
altas
y
frecuentemente
son
degradados
durante el proceso de secado.

Aislamiento
Si estamos buscando agliconas en el material vegetal,
podemos realizar un lavado con solventes no polares
como el caso de cloruro de Metileno, ter di etlico,
acetato de etilo. (aunque se encuentra raramente bajo
la forma de agliconas)
Normalmente la extraccin podemos realizarla bajo un
equipo soxhlet a 60 C durante 2 horas y comprobar la
presencia de Agliconas en dicho extracto.
Luego podemos proceder a realizar una extraccin con
mezclas de MeOH: H2O, la eficiencia de la extraccin
puede mejorar con sonificacion del material vegetal

Aislamiento
Los flavonoides en el material
vegetal se encuentran siempre
conjugados con o-glic o c-glic,
raramente se encuentra bajo la
forma de aglicona.
Para casos practico de aislamiento
sera
necesario
separar
estos
glucsidos del esqueleto de los
flavonoides, para esto se propone
una hidrolizar acida.

Aislamiento
Sistemas Cromatogrficos para la
extraccin: existen varios sistemas
para la extraccin de las Isoflavonas
mediante columnas Cromatogrficas.
Fases
estacionarias:
Poliamida,
Sephadex LH20, C18 RP
Fases Mviles: Migracin y mixturas de
compuestos Polares a Hidrfobicos

Solventes de
desarrollo

Serie
eluotropa

El poder eluyente
aumenta con la
Polaridad del
disolvente

-Hexano
-Tetracloruro de carbono
-Benceno
-Diclorometano
-Cloroformo
-Eter dietilico
-Acetato de etilo
-Acetona
-Isopropanol
-Etanol
-Metanol
-Agua

Aumenta
el poder
eluyente

Polaridad
creciente

Extraccin de
Flavonoides
Maceracin lixiviacin

Filtracin

Separacin por resina

AMBERLITE XAD2

Recuperar en MeOH

Rotaevaporar a 40C

Disolver en Agua

Aglicona

Someter a Hidrlisis
acida a 60C

Glicosidos

Extraer en BuOH y
redisolver en MeOH

Caracterizacin
Son
molculas
difciles
de
caracterizar,
normalmente
se
determinan
bajo
el
brillo
en
presencia de fluorescencia, de color
azul intenso, que cambia a Marrn
intenso en presencia de vapores de
amoniaco.

Caractersticas
espectrales de las
Isoflavonas

Espectroscopia UV

La banda II de absorcin de las

Isoflavonas normalmente ocurre en la
regin de 245-270 nm y generalmente
no es afectada por el incremento de la
Hidroxilacion del anillo B, pero si es
desplazada bato crmicamente por
Hidroxilacion del anillo A
Caractersticas de las espectroscpicas:

Isoflavonas Polioxigenadas, que tengan la banda

II de absorcin, entre 265 y 270 generalmente
son trioxigenadas en el anillo A.
La metilacin o Glicosilacion de 7 o 4-OH tiene
un pequeo o muy pequeo efecto sobre el
espectro UV, Mientras que una sustitucin en el

Espectroscopia uv

Reactivos de Desplazamiento

Tcnicas Espectromtricas
Los tipos de anlisis mas importantes
para el trabajo con flavonoides, son
los relacionados con la
Espectrometra de MS, MS/MS y la
RMN 1H y RMN 13C.
El trabajo con IR no ayuda en gran
manera, debido a la cantidad de
seales iguales, que se solaparan.

Espectrometra de masas

Espectrometra de masas

Es una tcnica instrumental sofisticada que

separa y detecta iones en fase gaseosa. Se basa
en ionizar molculas gaseosas convirtindolas en
iones (generalmente cationes), que se separan al
ser acelerados por un analizador de masa: la
separacin se basa en la distinta relacin m/z de
los iones.

ESPECTRMETRO DE MASAS

Componentes del instrumento

Introduccin de
la muestra

Fuente de
ionizacin

Separador de
masas

Detector
inico

Procesador
de seal
El acoplamiento entre CG y
HPLC con EM se analizar ms
adelante

Registrador

Fuentes de ionizacin
Ionizacin por impacto electrnico
Ionizacin qumica
Fuente de bombardeo con tomos rpidos
Desorcin con lser
Ionizacin a presin atmosfrica:
- Electronebulizacin asistida con un gas: electrospray
- Ionizacin qumica a presin atmosfrica
- Fotoionizacin a presin atmosfrica

HPLC

Ionizacin por impacto electrnico

molculas neutras
placa de repulsin
haz de electrones (70 eV)

filamento de W

placas focalizadoras

placas aceleradoras
(4000 V)

iones

M+e

M.+ + 2e
ion molecular

Fragmentacin del ion molecular

Molcula hipottica ABCD (A, B, C y D = tomos)
ABCD + e

ABCD.+ + 2 e

ABCD.+

A+ + BCD.
A. + BCD+
CD. + AB

B + A+
A + B+
D + C+
C + D+

AB. + CD+

ABCD.

ADBC.

ABCD. + ABCD
+

Fragmentacin del
ion molecular

BC+ + D

BC. + AD+
AD. + BC+
(ABCD)2.

Reordenamiento seguido de
fragmentacin

BCD. + ABCDA

Colisin seguida de
fragmentacin

Ionizacin qumica
Gas reactivo
metano, isobutano, amonaco (cmara de
ionizacin de alta presin a 10 torr)
CH4 + e (alta energa)

CH4+ y CH3+

CH4+ + CH4

CH5+ + CH3

CH3+ + CH4

C2H5+ + H2

Transferencia protnica entre molcula reactiva y analito

CH5+ + MH

MH2+ + CH4

C2H5+ + MH

M+ + C2H6

Separador de masas

Espectrmetro de masas de sector magntico

Espectrmetro de masas de cuadrupolo
Espectrmetro de masas de tiempo de vuelo
Espectrmetro de masas de trampa inica

Espectrmetro de masas de sector magntico

cmo se separan los iones de distinta masa?

m : masa
v : velocidad de la partcula
m : masa
z : carga
V : diferencia de potencial

Ecintica = mv2 = zV
v = (2zV/m)

FM = Bzv

mv2/r = Bzv

FC = mv2/r

v = Bzr/m

FM : fuerza centrpeta
FC : fuerza centrfuga
B : campo magntico
r : radio de curvatura

Bzr/m = (2zV/m)
m/z = B2r2/2V

Espectrmetro de masas de cuadrupolo

= 6 mm

Espectrmetro de masas de cuadrupolo

Potencial corriente directa

Potencial de radiofrecuencia

Relacin de voltajes durante un barrido de masa con un

analizador cuadrupolo

tiempo
masa

EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)

pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s

Espectrmetro de masas de trampa inica

Vrf

tapa

electrodo anular
central

tapa

Esquema detector de trampa inica (ITP)

Espectros de masas
Dependen de:
Energa de ionizacin de la molcula
Grupos funcionales de la molcula
Mtodo de ionizacin
Presin y temperatura de trabajo
Diseo instrumental

Espectros de masas obtenidos por impacto electrnico

Etilbenceno

pico base

En este ejemplo el pico

base se forma por prdida
de CH3

ion molecular (ion parent)

M fragmento de
mayor masa
+

tomos y grupos
frecuentemente
desplazados

molcula con nmero par de N M+ con masa par

molcula con nmero impar de N M+ con masa impar
4 H M-4
CH3 M-15
NH3 M-17
H2O M-18

F M-19
HF M-20
C2H2 M-26

Espectros de masas de cloruro de metileno

Impacto electrnico
pico base prdida de Cl

Picos isotpicos
12 1
C H235Cl2
(m= 84)
C1H235Cl2

13
12

(m= 85)

C1H235Cl37Cl (m= 86)

C1H235Cl37Cl (m= 87)

13

C1H237Cl2

12

(m= 88)

Espectros de masas de pentobarbital (sedante)

Impacto electrnico

Ionizacin qumica

El ion molecular (m/z = 226) prcticamente no se distingue

Espectros de masas de 1-decanol (PM = 158)

Impacto electrnico

Ionizacin qumica

Cromatografa Gaseosa Espectrometra de Masas

Sistemas de acople

Separador de chorro (columnas rellenas)

Ensamblaje con columnas capilares

cmara de
evacuacin

hacia la
bomba
A cmara
de
ionizacin

desde el
CG

constriccin
de entrada

tubo de vidrio
poroso

constriccin
de salida

collarn que se atornilla

en el receptculo de
fuente inica

Cromatografa Lquida Espectrometra de Masas

Sistema de acople

Sistema de ionizacin

Formacin de iones gaseosos a partir de analitos en solucin

Ionizacin a presin atmosfrica

Electronebulizacin asistida con un gas: electrospray (ESI)

Ionizacin qumica a presin atmosfrica (APCI)
Fotoionizacin a presin atmosfrica (APPI)

Electronebulizacin asistida con

un gas Electrospray (ESI)

Electrospray (ESI)
1. La fase mvil y el analito se
nebulizan (dispersados en pequeas
gotas)
2. El solvente de la fase mvil se
evapora de las gotas (desolvatacin)
3. La densidad de carga en las gotas
aumenta hasta alcanzar el lmite
Raleigh (10e8 V/cm3) y luego la gota
sufre explosiones de Coulomb y se
rompe en gotas ms pequeas.
4. Bajo la influencia de potenciales
electrostticos en la cmara de spray
(nube), el ion analito se desorbe de la
gota.

Electrospray

aerosol

lquido

Cundo es apropiado trabajar en ESI?

- Solutos ionizables de alto y bajo peso molecular. El
analito de inters debe ser capaz de portar carga en
solucin
Ejemplos:
a) Muestras que contienen heterotomos: carbamatos,
benzodiacepinas
b) cidos o bases
c) Especies inicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato,
aminas, etc
d) Muestras que se multi-cargan en solucin (ej: pptidos,
proteinas,
oligonucleotidos)

Ionizacin qumica a presin

atmosfrica
APCI

Ionizacin qumica a presin atmosfrica (APCI)

1. La fase mvil y el
analito se nebulizan
(dispersados en
pequeas gotas)
2. Las gotas se
evaporan.
3. Las molculas de fase
mvil se ionizan por
electrones provenientes
de una descarga
elctrica.
4. Las molculas de
analito se ionizan por los
iones de la fase mvil.

La muestra y el solvente
vaporizados entran en la regin
corona entre la aguja y el capilar

Las molculas de solvente se

ionizan en la regin corona de
descarga, transformndose en
iones gaseosos reactivos

Estos iones reactivos

reaccionan con las molculas de
muestra, ionizndolas

Ionizacin qumica a presin atmosfrica

H3O+(H2O)16

Cundo es apropiado trabajar en APCI?

Muestras:

Compuestos

de

peso

molecular/polaridad

intermedias: PAHs, PCBs, cidos grasos, ftalatos.

Compuestos

que

no

contienen

grupos

cidos/bsicos

(ej:

hidrocarburos, alcoholes, aldehidos, cetonas y esteres)

Muestras con heterotomos: ureas, benzodiacepinas, carbamatos
Muestras que exhiben un mal comportamiento ESI
Parmetros en solucin
Mucho menos sensible a las condiciones de disolucin que ESI
Tolera mayores flujos que ESI
Acomoda algunos solventes no compatibles normalmente con ESI
Muestras a Evitar
Debido a la evaporacin previa: muestras trmicamente lbiles,
muestras cargadas en solucin, biomolculas (habitualmente no
voltiles).

Fotoionizacin a presin atmosfrica

APPI

APPI (modo positivo)

El solvente y la muestra se
nebulizan y son
completamente
vaporizados por
calefaccin.
La ionizacin del solvente
y la muestra ocurre por
bombardeo con fotones a
partir de una lmpara UV

La molcula de analito M se ioniza a ion molecular (si el potencial

de ionizacin del analito es menor a la energa del fotn).
El ion M.+ puede extraer un hidrgeno del solvente para formar
[M+H]+

Un dopante fotoionizable en exceso y rinde muchos iones

moleculares.
El analito se ioniza por transferencia protnica a partir del
dopante o solvente
El in molecular del dopante ioniza al analito por transferencia
electrnica

Cundo usar APPI?

Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI
o APCI
(ej: PAHs).
Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos
(THC-tetrahidrocanabinol,
cido benzoico, vitaminas no
hidrosolubles).
Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que
APCI.

Es robusto y altamente reproducible.

Seleccin del sistema CL/EM

Peso molecular

100.000

ESI

10.000
APPI

1.000

APCI

No polar

Muy polar

Polaridad del analito

Registros grficos CG-EM y CL-EM

Cromatograma de corriente inica total

Cromatograma de in seleccionado
Arreglo tridimensional: seal en funcin del tiempo (informacin
cromatogrfica) y en funcin de la relacin m/z (informacin
espectroscpica)

Sntesis de 1Br-butano a partir de butanol (CG-EM)

CH3(CH2)3OH + Br-

CH3(CH2)3Br + OH-

1-butanol
1-bromobutano

cromatograma

EM pico 1

EM pico 2

Combustin de tela tratada con producto ignfugo

Cromatograma de
corriente inica
total (TIC)

EM de pico 12
(benceno)

Confirmacin presencia de cocana en orina por CG-masa

Cromatograma de corriente inica total

EM de testigo de cocana (m = 303)

a igual tiempo de elucin
EM del pico a 11.5 min

Mezcla de 6 herbicidas resuelta por HPLC-masas

Cromatograma
convencional
con deteccin
UV

Cromatograma de masas de corriente inica total

Deteccin de
un ion
seleccionado
m/z = 312
(corresponde a
MH+ formado a
partir de
imazaquina de
masa = 311)

Representacin de la estructura tridimensional de datos CG-EM en

modo barrido completo (full-scan)

Se obtiene: el cromatograma inico total, el cromatograma inico de un in

seleccionado (a determinada masa) y los espectros de masas (a
determinados tiempos de retencin)

MS en Flavonoides
Cantidad de muestra necesaria: Menos de un
1mg, esta tcnica junto con el anlisis UV y
los reactivos de desplazamiento.
La tcnica a escoger puede variar
dependiendo de la matriz y tipo de
flavonoides a analizar. (FAB, MALDI, TOF, EI)
El anlisis se debe llevar a cabo siempre con
agliconas, esto debido a que los glucsidos
son altamente termolbiles, incluso existiendo
una gran presin de vaco (3 x10-5 Torr)

RMN
Esta tecnica es muy usada para el analisis de
flavonoides, especialmente en las isoflavonas, al ser
estructuras altamente metiladas.
Ademas de ser muy solubles en el solvente que se
utiliza para la RMN CDCL3, sin embargo otra vez se
observa que el analisis de los glicosidos, disminuye
la solubilidad en CDCL3
Sin embargo el uso de DMSO d6, facilita de
sobremanera el analisis de glicosidos.
La utilizacion de TMS tambie es apropiada para el
analisis de Flavonoides, ya que generan rapidamente
derivados de estos.

Para la elucidacin
de la estructura
tomaremos
en
cuenta
los
siguientes puntos:
Protones
del
Anillo A
Protones
del
Anillo B
Protones
del
Anillo C
Protones
del
Glucsido
Metoxi y Acetoxi
Protones
Protones
del
carbono
y8
Nota:
Tener6en
cuenta si se usa
TMS, todos los OH
terminales seran
Trimetilsilil esteres.

Los protones de los carbonos 6 y 8 de las isoflavonas que

contengan sustituciones en los carbonos 5 y 7, presentaran 2
dobletes (J: 2.5cps) en el rango de 6.0 y 6.5. Los dobletes
correspondientes a H-6 ocurren consistentemente mas altos
que los del 8-H, cuando existen azucares en el C-7 la seal se
desplaza en el espectro

Otro caso comn es que la isoflavona presente una sustitucin en el C7 Cuando R=H, tenemos que los hidrogenos del carbono 5 genera un
doblete entre 7.9 y 8.2, El carbonos 6 generara un cuarteto entre 6.7 y
7.1 y el carbono 8 un doblete entre 6.7 y 7.0, cuando la sustitucin es
diferente a la de un H, todos los desplazamientos se ven reducidos.

Anillo B: para nuestro inters en las isoflavonas, los

desplazamientos como dobletes entre 7.2 y 7.5 y 6.5 y 7.1,
nos darn la explicacin de un enlace =C-C= en la posicin
3,
corroborando
la
presencia
de
la
estructura
correspondiente a las Isoflavonas.

Farmacologa

Isoflavonas
Las Isoflavonas presentan una gran cantidad
de actividades, aunque cabe resaltar que la
mayor cantidad de Isoflavonas presentar
actividad estrognica, de ah que reciben el
nombre de Fitoestrgenos.
Estos compuestos presentan una estructura
estrica muy similar a la de esteroidal de los
estrgenos, por lo cual se unen fcilmente a
los receptores estrognicos. De ah que
produces
una
infinidad
de
efectos
estrognicos o anti estrognicos.

Absorcin, Metabolismo y excrecin

Las isoflavonas son absorbidas a nivel de
la parte superior del intestino delgado.
Pasan la barrera hematica alrededor de
una hora despus de haber sido ingeridas.
Son absorbidas bajo la forma de aglicona,
por lo que previamente se realizada un
hidrolisis enzimtica, por la B-glicosidasa
de la flora bacteriana o por la enzima
instestinal, lactasa-florizina hidrolasa.

Absorcin, metabolismo y excrecin

Posteriormente a nivel de la mucosa intestinal
son convertidas a la forma de B-glucoronico por
la
enzima
UDP-Glucoroniltransferasa
,
convertida luego bajo
la forma de sulfato
catalizado por PAPS. Estos procesos ocurren a
nivel del Hgado.
Luego estos son excretados a nivel biliar, y
reabsorbido en la porcin final del intestino
delgado, creando un ciclo entero-hepatico.
Para ser luego excretado va urinaria, bajo la
forma de DMA (desmethylangolensin).

Mecanismo de Accin
Sntomas
Menopasicos:
Las isoflavonas con
su
estructura
estrica similar a la
del estrgeno, se
une a sitio receptor
de
estrgenos,
produciendo efectos
vasomotores
importantes,
diversos
estudios
clnicos, dan como
dosis diaria 135 mg
de
Isoflavonas
expresadas
como
mg de Genisteina.

Efectos Benficos
Anticancergeno: Uno de las posibles
explicaciones,
o
modelos
de
mecanismo de accin es tan
indicados a que las isoflavonas,
evitan la proliferacin de clulas
cancergenas activando las vas de
apoptosis, inhibicin de la Tirosina
Quinasa, y regulacin de los ciclos
hormonales.

Efectos Benficos
Efectos sobre la cognicin: El hecho
de activar receptores hormonales, da
como resultado un incremento en la
produccin de neurotransmisores, lo
cuales van a producir una mayor
actividad
cerebral,
llegando
a
mejorar los procesos cognitivos del
cerebro.

Practica de Laboratorio
Traer:
Mta problema (planta, material
vegetal, materia biologico), que
contenga una cantidad y molecula
conocida de Isoflavonas.
Jeringas de 10 ml
Guantes
Guardapolvos
Muchas Ganas de trabajar

FIN
Gracias