Tcnicas de biologa molecular

II Semestre
Facultad de me medicina

ZOHAR ESTRADA CASSIANI

DANIELA CASTILLO CRISMATT
FRANCO ALANDETE VICTOR HUGO

A qu se denominan
tcnicas de biologa
molecular?
En principio se denomina as a todas las tcnicas
de laboratorio que se usan para aislar ADN o
extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su
estado, cortarlo y pegarlo, amplificar una regin
en una enorme cantidad de molculas (clonacin
de fragmentos en bacterias u otros vectores
como virus , PCR Etc.

para que se utilizan estas

tcnicas?

Todas estas tcnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el

diagnstico de enfermedades hereditarias, bsqueda de alelos mas o
menos frecuentes asociados a una caracterstica que nos interesa
seleccionar, diagnstico de contaminacin bacteriana en alimentos ,
diagnstico viral o de infeccin viral (VIH, Hepatitis C, PIF, otros),
seleccin de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento
gentico de una especie, test de paternidad, diagnstico de identidad
forense, etc.

Extraccin del ADN

La primera tcnica que todas las dems necesitan es la extraccin del
ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque
usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados
de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las protenas del
medio, detergentes para eliminar las membranas plasmticas y luego ir
purificando el ADN de esa mezcla de ARN protenas y restos celulares.

La figura muestra el pellet de

clulas a partir del cual se
obtendr el ADN

As se ve el ADN recin extrado en

alcohol.

Reaccin en cadena
de polimerasa (PCR)

Objetivos
Conocer:
Los fundamentos de la tcnica de amplificacin de ADN
por PCR
Usos y aplicaciones de PCR
Ventajas y desventajas del PCR

PCR
Polimerase chain reaction
Es la amplificacin de ADN in vitro por medio de la
polimeracion de cadena de ADN utilizando un
termociclador.
Es propsito del PCR es hacer muchas copias de un
fragmento de ADN
Se realiza la amplificacin de un segmento especifico
de ADN, teniendo poco material disponible.

PCR
Polimerase chain
reaction
Fue diseada por el Dr. Kary Mullis
en 1987
Gano el premio nobel de qumica en
1993 por su invento
Utilizo el PCR para amplificacin
del gen de - hemoglobina humana,
y el diagnostico prenatal de anemia
falciforme.

Termociclador
La PCR se realiza en un thermo
cycler o termociclador

* Es una maquina que calienta y

enfra la reaccin de periodos cortos
de tiempo.

El proceso de PCR incluye 3 pasos

bsicos que se repite 25 veces o
mas.
1: DESNATURALIZACION: Consiste en separar la doble hebra de ADN y
convertirla en hebra sencilla.
Tpicamente se usa a una temperatura de 25C 95, Por 15 a 40 segundos
El tiempo depende del tamao del genoma

2: APAREAMIENTO O ANNELING:
Los cebadores primers previamente diseados, reaccionan con la
hebra sencilla del ADN y se pega a lugares especficos por
complementariedad de base. Por eso se deja bajar la temperatura
Ej: 55 C por 30 segundos. La temperatura y el tiempo puede variar
entre cebadores segn sea el caso.

3. POLIMERACION O EXTENSION.
Una polimerasa de ADN extiende los primers en el espacio
comprendido entre ambos primers, y coloca dinucleotidos
trifosfatados (dNTPs) de 5a 3leyendo el ADN de 3a 5. de
esta forma se sintetiza la secuencia complementaria de las
hebras de ADN molde.

El PCR es una amplificacin

exponencial

Polimerasa
En un principio, la polimerasa de ADN que se utilizaba
era de bacterias E.Coli, pero esta es sensitiva a altas
temperaturas, por lo que haba que aadir enzimas
fresca al comenzar el tercer ciclo.
Se remplazo la enzima por la de la bacteria thermus
aquaticus conocida como Taq pol

Anlisis de muestra
La deteccin del producto de la PCR se
realiza normalmente mediante corrido
electrofortico.
Dependiendo del tamao de la
amplificacin y la resolucin que
deseamos utilizaremos diferentes medios
(agarosa, poliacrilamida) a distintas
concentraciones.

La posterior visualizacin se puede realizar por bromuro

de etidio (lmpara de luz UV) Tincin de plata,
fluorescencia, radioactividad

Aplicacion
es

Deteccin de agentes infecciosos como : hepatitis B y C,

papiloma virus, VIH, entre otros.
Anlisis de ADN de cualquier organismo vivo o muerto, anlisis
de fsiles.
Mutagnesis dirigida (cambios en la informacin contenida a
travs de los primers con mutaciones)
Investigacin forense
Pruebas de paternidad

Ventajas del PCR

A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener una
cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.
El proceso se puede utilizar para clonar, secuenciar y anlisis.
Se puede amplificar el ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
Sus aplicaciones son multiples,
anlisis prenatales, etc.

medicina

forense,

diagnostico,

Desventajas del PCR

Se puede reproducir solamente parte del genoma en donde se
conoce por lo menos una mnima secuencia 20 40 pd
Se necesitan primers especficos que sean complementarios al
fragmento que se desea sintetizar.
La polimeracion puede tener errores al sintetizar el ADN.
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo
investigador o de cualquier otro)

Electroforesis en gel
Electroforesis en gel es una de las principales herramientas de la biologa
molecular. El principio bsico es ADN, ARN, y protenas que pueden ser separadas
por medio de un campo elctrico. El ADN y ARN pueden separarse de tamao
ejecutando el ADN a travs de un gel de agarosa. Las protenas pueden separarse
de tamao mediante el uso de un gel de SDS-PAGE

Se utiliza generalmente con

propsitos analticos, pero puede
ser una tcnica preparativa para
purificar molculas parcialmente
antes de aplicar espectrometra de
masa, PCR, clonacin o
secuenciacin de ADN.

MICRORRAY

Qu son los microrrays?

Son un tipo de biochip : es un dispositivo a pequea escala, anlogo a un
circuito integrado, ensamblado de molculas orgnicas asociadas a
organismos vivos
En este caso las molculas orgnicas son fragmentos de ADN
seleccionados del genoma.

Estos microrrays son pequeos dispositivos

de cristal con orificios rellenos de ADN
marcados con sustancia fluorescente

Para que se utilizan los microrrays?

Para detectar anomalas del ADN (delecciones ,
duplicaciones, etc.)
Para diagnosticar enfermedades que causan
alteraciones en el ADN: ( Cncer, Esquizofrenia,
Autismo etc.)
Para simples diagnsticos.
Para reparar genes alterados.

Southern blot

EDWIN SOUTHERN DESARROLLO ESTA TECNICA EN 1975

Southern blot
Sirve para detectar por hidrolisis la presencia de una porcin
de ADN en una muestra.
Fundamento: complementariedad de bases
Se disea una sonda con nucletidos marcados que sean
complementarios al sector de ADN buscado.
El sector de ADN buscado puede ser un gen, o parte del mismo.
Se puede utilizar para el diagnostico molecular de patologas
genticas.

Southern blot
HIBRIDACION.

La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDAmuestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es
la muestra en simple cadena)
Los nucletidos de la sonda estn marcados P 32 (radiactivos) si al
revelar hay marcador radiactivo presente, esta en la muestra analiza
la secuencia complementaria a la sonda.

Pasos de la hibridacin
Se agrega la sonda sobre la membrana y se incuba
Se lava para quitar el mximo de hibridaciones inespecificas.
Se revela por auto radiografa.

Pasos previos a la hibridacin :

 Separacin de fragmentos
Extraccin del ADN
Fragmentar en ADN en porciones mas pequeas (enzimas
de restriccin)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electrofortica usando como sustrato de migracin un
gel (separacin por tamao)

 Inmovilizacin de los fragmentos en

soporte solido

Desnaturalizacin con solucin salina alcalina ( SIMPLE CADENA)

Transferencia a soporte solido (membrana de nylon / nitrocelulosa): por

capilaridad o electroforesis: pasan del gel a la membrana.
Se agrega solucin (NaCl) para evitar rehibridacin previa al colocar la
sonda.

Western blot

 Que es el Western blot?

Es una tcnica analtica usada para detectar protenas especificas en
una muestra determinada. Mediante una electroforesis en gel se
separan las protenas.
Las protenas son transferidas desde el gel a la membrana
electrofortica

Northern blot

Qu es el Northern blot?
Se utiliza para estudiar los patrones de expresin de un tipo
especfico de la molcula de ARN como comparacin relativa entre
un conjunto de diferentes muestras de ARN. Es esencialmente una
combinacin de desnaturalizacin electroforesis en gel RNA y una
mancha. En este proceso de ARN est separado basado en tamao y
es transferido a una membrana que luego es sondeada con un
etiquetado como complemento de una secuencia de inters.

Bibliografa
Seminario de fundamento y procedimiento de las pruebas de WESTERN BLOT
http://www.slideshare.net/tratamiento1/fundamento-y-procedimiento-de-las-pruebas-de-western-blot?fr
om_search=4
Newmwdical : tcnicas de biologa molecular
http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques-(Spanish).aspx
Blot educativo de gentica clsica y estructural (tcnicas de biologa molecular)
http://genmolecular.wordpress.com/tecnicas-de-biologia-molecular/
Amplificacin de ADN in vitrio: PCR (polymerase chain reaction)
http://www.slideshare.net/svls89/pcr-2899058
Seminario de gentica : tcnicas de biologa molecular
http://www.slideshare.net/BernardoOro/tecnicas-de-biologa-molecular
MICRORRAYS DESENMASCARAN ENFERMEDADES ESCONDIDAS
http://www.slideshare.net/jkv/micro-arrays-presentation
Wikiperdia: Western blot
http://es.wikipedia.org/wiki/Western_blot