INMUNODIAGNOSTICO

DR. CARLOS ESQUERRE AGUIRRE

MEDICO PATOLOGO CLINICO HVLE

INMUNOANALISIS
SON TECNICAS PARA

DETECTAR Y CUANTIFICAR
AG O AC.
UN IE DEBE SER CONFIABLE,

OPORTUNO Y EFICIENTE.

Inmunoanlisis
La gran especificidad de Ac, los hace de gran

utilidad como reactivos para detectar, cuantificar

y purificar Ag
Debido a que puede producirse Ac prcticamente
frente a cualquier molcula, se les puede usar
para estudiar cualquier tipo de molcula

Inmunoanlisis
Basado en la presencia de un Ag o Ac, cuya

cantidad puede determinarse por medio de una

molcula indicadora
Cuando la molcula indicadora es marcada con
un radioistopo, (Yalow y Berson, 1959) se
puede cuantificar ultizando instrumentos que
detectan la descomposicin radioactiva. RIA

Inmunoanlisis
Cuando la molcula indicadora est unida

covalentemente a una enzima, puede cuantificarse

determinando la capacidad de la enzima de
transformar un sustrato transparente en un producto
coloreado
A este se le llama enzimoinmunoanlisis

CLASIFICACION DE IE
POR USO DE MARCADOR
SIN MARCA: PRECIPITACION,

INMUNOELECTROFORESIS,
NEFELOMETRIA,
INMUNOTURBIDIMETRIA.
CON MARCA: ISOTOPICOS Y NO
ISOTOPICOS (ENZIMATICOS Y NO
ENZIMATICOS)

CLASIFICACION DE IE
DE ACUERDO AL METODO DE

DETECCION:
COLORIMETRICO
FLUORESCENTE
QUIMIOLUMINISCENTE

CLASIFICACION DE IE
SEGN EL DISEO DEL

SISTEMA DE REACCION:
HOMOGENEO Y
HETEROGENEO
COMPETITIVO O NO
COMPETITVO

NOMENCLATURA
SE HA RECOMENDADO LLAMAR:
INMUNOENSAYO (RADIO, ENZIMO Y

FLUOROINMUNOENSAYO) A
AQUELLOS QUE SON DE DISEO
COMPETITIVO.
ENSAYO INMUNOMETRICO
(INMUNORADIOMETRICO, ETC) PARA
AQUELLOS NO COMPETITIVOS

EMPLEO DE MARCADORES Y
NOMENCLATURA DE LOS IE
EL ANALISIS TIPO I (EXCESO DE

ANTICUERPO) ESTA BASADO EN

MARCAR EL AC REACTIVO.
EL TIPO II (EXCESO DE ANALIZADO),

SE MARCA LA SUSTANCIA
ANALIZADA.

Coloides
metlicos
Ltex

Enzima

Marcado
Radioistopo

Fluorforo
Hemates

Partculas de
colorante

LIMITES DE DETECCION DE
MARCADORES DE INMUNOENSAYOS
MARCADOR
FOSFATASA

ALCALINA
EUROPIO QUELATO
YODO 125
ESTER DE
ACRIDINIO
RUTENIO

CRITERIOS PARA SELECCIONAR

UN MARCADOR ENZIMATICO
PUREZA
SENSIBILIDAD
FACILIDAD DE VELOCIDAD DE DETECCION
AUSENCIA DE FACTORES QUE INTERFIERAN
GRUPOS REACTIVOS POTENCIALES
ESTABILIDAD
IDONEIDAD PARA UN EIA HOMOGENEO

Ventajas EIA frente a RIA

Se evita la exposicin a radiaciones
Reactivos ms estables
No se requiere instalaciones ni autorizaciones

especiales
Mediciones rpidas y fcilmente automatizables
Costo

ELISA
Elemento de captura en la fase slida.
Anticuerpo en el suero del paciente (+) o (-)
Reaccin con el conjugado
Cambio de aspecto del substrato por accin de la Enzima
.
El cambio de aspecto del substrato es proporcional a la
cantidad del elemento puente es decir el anticuerpo presente
en el suero del paciente positivo.
El suero que no aporta el elemento puente (anticuerpo) , no
mantiene a la enzima en el sistema y por lo tanto no se
producen cambios en el aspecto del substrato y es negativo

ELISA
(+)

(-)

Antgeno-Anticuerpo y conjugado antiglobulina - Enzima

Cambio de color del substrato

Concentracin relativa

Respuesta Inmunolgica
Ag
Infeccin

Seroconversin

Das

IgG

IgM

Semanas

Meses

Aos

ELISA
Reaccin
antgenoanticuerpo
Antgeno

Anticuerpo

Ag - Ac

Elisa : Reaccin
muestra - conjugado

Elisa: Reaccin del sustrato

Cromgeno

O2

H2O2

H2O
Tampn sustrato

TMB

Bioelisa :
Leyendas
Anticuerpo
de captura

Antgeno
recubriendo
el pocillo

Anticuerpo IgG

Anticuerpo IgM

Antgeno

Conjugado

Deteccin de IgG
TMB

Fase
Solida

Muestra
Conjugado

Deteccin de Antgen
TMB

Fase
Solida
Muestra

Conjugado

Deteccin de IgM: Inmunocaptur

TMB
Fase
Solida
Muestra

Conjugado

Protocolo
standard
bioelisa:
1.- Agregar
muestra

37C

Lavado

Protocolo
standard
bioelisa:
2.- Agregar el
Conjugado

37C

Lavado

Protocolo
standard
bioelisa:
3.- Agregar del
Sustrato
TMB
H2O2
H2O2 TMB TMB
TMB
H2O2
H2O2
TMB

Temp. Amb.

Protocolo estndar
bioelisa:
4.- Agregar
Solucin de
parada
H2SO4

Sensibilidad

Reproducibilidad

Especificidad

Estabilidad

Facilidad de uso
Automatizable

Por qu falsos
positivos?
Antgeno HIV
soluble fijado en
la placa

Espacios libres
cubiertos por la
Albmina
bovina

IgG contra Albmina bovina

IgG especfica contra HIV

HIV Positivo verdadero

Falso positivo

Por qu falsos
positivos?

HIV Positivo verdadero

HIV Falso positivo

RADIOINMUNOANALISIS
As como en el sistema ELISA usamos una

enzima y valoramos los cambios en el aspecto del

substrato , en el RIA nos valemos de un
ISOTOPO RADIOACTIVO unido a sistemas de
anticuerpos .
Las lecturas se hacen por una valoracin de la
cantidad de radiacin emitida , la que es
proporcional a la concentracin del analito
estudiado .

RADIOINMUNOANALISIS
VALIDACION: CONSISTE EN

COMPARAR SU RENDIMIENTO CON

OTRO DE REFERENCIA
TRANSFERIBILIDAD:
TIEMPO DE REALIZACION:
SUSTANCIA PROBLEMA MARCADA.

RADIOINMUNOANALISIS
LOS METODOS RIA OFRECEN

UN CONSIDERABLE
ATRACTIVO POR SU EXTREMA
SENSIBILIDAD, SU RELATIVA
FACILIDAD DE CREACION Y SU
COSTO RELATIVAMENTE BAJO.

COMPONENTES DEL
SISTEMA RIA
SUSTANCIA: AG NO MARCADO.
AG MARCADO.
AC.
MEDIO DONDE OCURRE LA

REACCION.
ISOTOPOS COMO TRAZADORES: 3H Y
125I .

QUIMIOLUMINISCENCIA
El principio de la prueba es similar al de

ELISA es decir una reaccin de antgeno y

anticuerpo .
Esta reaccin se objetiva por la produccin
de luz a partir de una molcula de alta
energa que es descompuesta por actividad
enzimtica.
La cantidad de luz producida es
proporcional al analito investigado.

VENTAJAS DE LA
QUIMIOLUMINISCENCIA
PRESENTAN UN GRAN INTERVALO LINEAL.
BAJO LIMITE DE DETECCION.
ELEVADA ESPECIFICIDAD Y RAPIDEZ.
LA MAYORIA SON PROCEDIMIENTOS DE UN

PASO.
NO ES NECESARIO LARGAS INCUBACIONES.
ESTABILIDAD DE COMPUESTOS
LUMINISCENTES

FACTORES QUE AFECTAN

LAS MEDICIONES QLC
EL PH ES UNA VARIABLE IMPORTANTE.
LAS REACCIONES SON DEPENDIENTES

DE LA TEMPERATURA.
LOS COMPONENTES SERICOS COMO
ADENINA Y NUCLEOTIDOS DE
PIRIDINA. (LAVADOS).
LA LUZ AMBIENTAL

ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA
UTILIZACION DE MARCADORES NO

ISOTOPICOS MUY ESTABLES.

LA ELEVADA DETECTABILIDAD.
EL AMPLIO INTERVALO DE MEDIDA
LA FACIL SEPARACION DE LA FASE

LIGADA DE LA LIBRE.

NECESIDADES
EMERGENTES EN LOS
ANALISIS
MENORES LIMITES DE DETECCION.
DETECCION DE ANALITOS DE BAJO PM.
MAYOR ESPECIFICIDAD.
VELOCIDAD DE PROCESAMIENTO DE

GRAN NUMERO DE MUESTRAS.

DIAGNOSTICOS RAPIDOS.