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o diagnstico
microbiolgico
Indicao dos
testes moleculares
Custo-efetividade
Interpretao
Clssico x
molecular
A indicao dos
testes moleculares
e sua interpretao
CAMINHOS PARA O
DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO
Curso:
A indicao dos
testes moleculares
e sua interpretao
CAMINHOS PARA O
DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO
Deteco do microrganismo
Deteco da resposta imune
Fase aguda
Fase crnica ou cura
DETECO DO
MICRORGANISMO
Genma
Hibridizao, PCR
Protenas
Aglutinao, ELISA, RIE, QL, HPLC
Visualizao direta
Tcnicas de colorao, IFD, P.
monoclonal
Isolamento em cultura
Deteco da resposta
imune
Fase da infeco
Primria ou secundria
Cura
Cronicidade
Serufo JC, Clemente WT. Princpios Gerais do Diagnstico DIPs, 2002, 657-82.
F lu x o g r a m a 1 : E s t u d o m ic r o b io l g ic o
V r u s
B a c t r ia s
v ir o s e s a g u d a s
(q u e u s u a lm e n te
n o e v o lu e m
p / c r o n ific a o
v ir o s e s c r n ic a s
H IV , H C V , H B V
v ir o s e s e m
i m u n o d e f ic i e n t e s
1 .fa s e a g u d a
2 .fa s e d e d o e n a
3 .fa s e d e c u r a
1 .fa s e a g u d a
2 .fa s e c r n ic a
3 .c o n tr o le d e
tr a ta m e n to
(c ic a triz s o ro l g ic a )
flu x o g r a m a 2
com uns
a e r b ic a s
fa c u lta tiv a s
n o f a s t i d io s a s
f a s t id i o s a s
a n a e r b ic a s
in tr a c e lu la r e s
flu x o g r a m a 4
flu x o g r a m a 5
Fungos
P a r a s ito s
O u tro s
lo c a liz a d o s
s is t m ic o s
lo c a liz a d o s
s is t m ic o s
fa s e a g u d a
fa s e c r n ic a
P r io n s
V ir u s id e s
V ir in o s
flu x o g r a m a 7
f lu x o g r a m a 8
f lu x o g r a m a 9
m i c o b a c t r ia s
tu b e r c u lo s a
e a tp ic a s
flu x o g r a m a 3
flu x o g r a m a 6
Serufo JC.
Diagnstico Laboratorial nas Doenas Infecciosas.
In: Couto RC, Pedrosa TG, Nogueira TMG. 3a.ed.,
Medsi, 2003. 904p., p.725-56.
VIROSES CRNICAS
Fase aguda
Fase de latncia
Fase de doena
Viremia
Replicao viral
Resposta imune
Viremia
Diagnstico
Carga viral
Genotipagem
Controle
V ir o s e s : la t n c ia e c r o n ific a o
DIAGNSTICO
DE VRUS QUE
H IV , H C V , H B V , h e s p e s v ir id a e
v ir o s e s e m tr a n s p la n ta d o s
EVOLUEM
e i mPARA
u n o s s u p r i m i dCRONICIDADE
os
fa s e a g u d a
a n tic o r p o s n e g /p o s
a n tg e n o n e g /p o s
H IV
H B V , H C V c r n ic a s
HSV, CM V, EBV,
V Z V , V J B , ...
fa s e d e c r n ic a
la te n te /r e p lic a n te
a n tic o r p o s p o s
a n tg e n o n e g /p o s
la te n te
in c o r p o r a d a
ao genom a
hum ano
1 .s a n g u e e m E D T A
2 .liq u o r , lq u id o s
3 .te c id o a fe ta d o
1 .s a n g u e e m E D T A
2 .liq u o r , lq u id o s
3 .te c id o a fe ta d o
1 .C u ltu r a v ir a l c o m
tip a g e m m o n o c lo n a l
2 .h ib r id iz a o in s itu
3 .A n tg e n o v ir a l
C u ltu r a n e g a tiv a
H ib r id iz a o n e g
V ir e m ia n e g a tiv a
4 .P C R p / d e te c o
g e n o m a v ira l
5 .S o r o lo g ia Ig M , Ig G
6 .A n tg e n o s v ir a is
1 .P C R p / d e te c o l
g e n o m a v ir a l
2 .P C R R N A m
3 .P m o n o c lo n a l
D o e n a a tiv a
r e p lic a o v ir a l
e /o u v ir e r m ia
C o n tr o le d e
tr a ta m e n to
c o m a n tiv ir a is
1 .C o n tr o le d a
r e p lic a o v ir a l
e m te c id o o u
rg o a fe ta d o
1 .H IV : C D 4 /C D 8
2 .B i p s ia : H C V e H B V
3 .P C R in s itu
d ia g n s tic o d e
c e rte z a a p s
E lis a e W e s te r n b lo t
p o s itiv o s
C o n tr o le d a v ir e m ia
1 .s a n g u e e m E D T A
2 .P la s m a c o n g e la d o
1 .s a n g u e e m E D T A
2 .lq u id o c o r p r e o
3 . r g o o u te c id o
1 .C a r g a v ir a l
2 .P C R p / q u a n tific a o
de DNA ou RNAm
1 .H ib r id iz a o
2 .P C R p / d e te c o
d e D N A g e n m ic o
e /o u R N A m
Curso:
A indicao dos
testes moleculares
e sua interpretao
meningoencefalites virais
Aspecto: purulento
Citometria:
Citologia: PMN
Glicorraquia:
Proteinorraquia:
Meningite bacteriana
Febre
Cefalia
Vmitos
Sinais de irritao menngea
Outros
Meningite no purulenta
Aspecto: opalescente
Citometria:
Citologia: MN
Glicorraquia:
Proteinorraquia:
Meningite por
micobactrias ou
fungos
Meningites no purulentas
e meningoencefalites
Virais
Neurossfilis
Faixa
etria
Neonatos : VHS 2, CMV, rubola
< 20 anos: VHS 1, varicela-zoster,
sarampo, enterovrus
> 20 anos: VHS 1, varicela-zoster,
enterovrus
Bacteriana inicial
Outras
HSV 1 e 2
Tratamento
2 a 3 ml
Evitar inibidores
(detergentes, xilocana, heparina,
etc.)
Custo-benefcio
Pesquisa monoclonal para enterovrus:
Coxsackie A, Coxsackie B, Echovirus e
outros enterovrus
Reao em cadeia da polimerase (PCR)
para Herpesvrus tipo 1 e tipo 2
Disponibilidade de antivirais
CUSTO EFETIVIDADE
BAIXA CONCENTRAO
VIABILIDADE DO MICRORGANISMO
AGENTES FASTIDIOSOS
VRUS
TEMPO DE CRESCIMENTO
micra
CUSTO EFETIVIDADE
BAIXA CONCENTRAO DO AGENTE
LQUOR
DERRAME PLEURAL
LQUIDO PERICRDICO
ASCITE
ASPIRADO MEDULAR
SANGUE
micra
CUSTO EFETIVIDADE
VIABILIDADE DO MICRORGANISMO
MOMENTO DA COLETA
INCIO DA INFECO
FASE CRNICA
CONSERVAO E TRANSPORTE
POSSIBILIDADE DE CULTIVO
micra
CUSTO EFETIVIDADE
INTRACELULARES
FASTIDIOSOS ANAERBIOS - VRUS
Legionella spp.
L. pneumophila
Chlamydia spp.
Mycoplasma spp.
Rickettsia spp.
Anaerbios
Vrus
micra
CUSTO EFETIVIDADE
VRUS DIFICULDADES TCNICAS
Coleta e conservao
Infraestrutura laboratorial
Cultura de clulas
micra
CUSTO EFETIVIDADE
TEMPO DE CRESCIMENTO
DIAGNSTICO RPIDO
TIPAGEM
RESISTNCIA A DROGAS
MICOBACTERIAS
Cultura: 2 a 6 semanas
PCR: 1 a 2 dias
HERPESVIRUS
tratamento
Cultura: 5 a 7 dias
PCR: 1 a 2 dias
CUSTO EFETIVIDADE
DESVANTAGENS
CONTAMINAO DA AMOSTRA
PRESENA DE INIBIDORES
VIABILIDADE DOS AGENTES RNA
CUSTO
PADRONIZAO
micra
CUSTO EFETIVIDADE
CUSTO
ACURCIA
VANTAGENS
DESVANTAGENS
CORRESPONDNCIA CLNICA
micra
CUSTO EFETIVIDADE
CORRESPONDNCIA CLNICA
PADRO OURO
PRESENA DO GENOMA
VIABILIDADE DO MICRORGANISMO
ETIOLOGIA DA DOENA
micra
Pergunta fechada:
A amostra a ser examinada
contm determinado
microrganismo?
micra
O resultado POSITIVO
confirma a etiologia
da doena atual?
micra
O resultado NEGATIVO
afasta a hiptese etiolgica
para a doena atual?
micra
VALIDAO DO
RESULTADO
Validao do resultado
Resultado positivo
Resultado negativo
micra
INTERPRETAO
DOS
RESULTADOS
VALIDADOS
CRITRIOS
BAAR AURAMINA CULTURA
N
N
N
N
N
P
P
P
P
N
N
N
N
P
P
P
P
P
N
P
N
P
P
N
N
P
P
CONCORDNCIA 80,1%
NMERO DE
PCR
AMOSTRAS
N
P
P
N
P
N
P
N
P
44
14
8
1
1
1
2
1
69
141
MTODOS CLSSICOS
X
MOLECULARES
BAAR POSITIVO
MTODO
MOLECULAR
CULTURA
PESQUISA
MONOCLONAL
DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO
CLSSICO
e / ou
MOLECULAR
DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO
Tcnicas diretas
Colorao de Gram
Pesquisa de BAAR
Pesquisa direta de fungos
Pesquisa de fungos pela nigrosina
Pesquisa de fungos pelo KOH
Pesquisa de fungos pelo Lactofenol
Colorao de Giemsa
micra
micra
Pesquisa
monoclonal
Especificidade: ~100%
qualidade do anticorpo
Sensibilidade: 0 a ~100%
nmero de clulas infectadas
fase da doena
micra
CULTURAS
Cultura convencional
Cultura automatizada
Cultura para anaerbios
Cultura para fungos
Cultura para micobactrias
Cultura para micoplasma/ureaplasma
Cultura para clamdia
Cultura para legionela
Cultura para hemfilos
micra
Variaes da PCR
micra
Iniciadores especficos
Quantificao do segmento-alvo
Automao da quantificao
Rapidez e confibilidade
Custos
Diagnstico molecular
Genotipagem
Epidemiologia
Resistncia a drogas
Diagnstico
Tratamento
Prognstico
Diagnstico molecular
Como pedir?
PCR para:
micoplasma, clamdia,
Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittacii,
Legionella pneumophila, M. avium, Nocardia
asteroides, Treponema pallidum, Candida
albicans, leismania, toxoplasma, adenovrus,
rinovrus, coxsackievrus A, coxsackievrus B,
influenza A, influenza B, parainfluenza, ....
micra
RNA
micra
- Molecular Hybridization
DNA Chip, Microarray
- Eletrophorisis (lab-on-a-chip)
MCE Chip
MICROARRAYS
DNA CHIP
DNA Chip
RNA m
DNA
MICROFLUIDIC SYSTEMS
MCE Chip
Chips with different ways of
integration in some reactions
and analytical process
(eletrophorisis,
cromatography, PCR, etc.)
Technology Lab-on-a-chip
LabChip (Agilent)
and Quick DNA Chip (Genolife), (30 min)
30 min
No hybridisation
No - skilled users
30 min
PCR confirmed by
hybridisation
No - skilled users
Colorimetric analysis
AAT workstation
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO
H INFECO?
PRINCPIOS DO DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO
A amostra devidamente coletada deve
ser levada ao laboratrio prontamente
Os cultivos devem ser feitos em meios
frescos e adequados
O valor clnico do exame microbiolgico
no pode ser maior do que a confiana que
merece o laboratrio que o executou
Kolmer JA, Clinical Diagnosis by Laboratory
Examinations,. 1 edio, 1945.
micra