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ENZIMAS - HISTRICO
Catlise biolgica incio sc. XIX
digesto da carne: estmago;
digesto do amido: saliva.
Dcada de 50
Louis Pasteur - concluiu que a fermentao do
acar em lcool pela levedura era catalisada por
fermentos = enzimas.
Eduard Buchner (1897)
extratos de levedo podiam fermentar o acar at
lcool;
enzimas funcionavam mesmo quando removidas
da clula viva.
ENZIMAS - HISTRICO
James Sumner (1926)
Isolou e cristalizou a urease;
Cristais eram de protenas;
Postulou que todas as enzimas so protenas.
John Northrop (dcada 30)
Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas;
Dcada de 50 sc. XX
75 enzimas isoladas e cristalizadas;
Ficou evidenciado carter protico.
Atualmente + 2000 enzimas so conhecidas.
ENZIMAS
Aminocidos:
H
Definio:
Catalisadores biolgicos;
R
C*
COOH
Longas cadeias de pequenas molculas
chamadas aminocidos.
NH2
Funo:
Viabilizar a atividade das clulas, quebrando
molculas ou juntando-as para formar novos
compostos.
Com exceo de um pequeno grupo de
molculas de RNA com propriedades catalticas,
chamadas de RIBOZIMAS, todas as enzimas so
PROTENAS.
ENZIMAS PROTENA
Classificao protenas
Protenas globulares
Protenas fibrosas
Estrutura das protenas
Primaria
Secundaria
Terciria
Quaternria
ENZIMAS
Protenas globulares
Estrutura terciria
ENZIMAS ESTRUTURA
Estrutura
Enzimtica
Holoenzima
Protena
Ribozimas
RNA
Apoenzima ou
Apoprotena
Cofator
Pode ser:
on inorgnico
molcula orgn
Coenzima
Se covalente
Grupo Prosttico
ENZIMAS
Comparao das enzimas com catalisadores qumicos.
Caracterstica
Enzimas
Catalisadores Qumicos
alta
baixa
Natureza da estrutura
complexa
simples
Sensibilidade T e pH
alta
baixa
suaves
drstica (geralmente)
alto
moderado
batelada
contnuo
Consumo de energia
baixo
alto
Formao de subprodutos
baixa
alta
difcil/cara
simples
alta
baixa
Presena de cofatores
sim
no
Estabilidade do preparado
baixa
alta
Energia de Ativao
baixa
alta
alta
baixa
Especificidade ao substrato
Velocidade de reao
ENZIMAS NOMENCLATURA
Sculo XIX - poucas enzimas identificadas
- Adio do sufixo ASE ao nome do substrato:
* gorduras (lipo - grego) LIPASE
* amido (amylon - grego) AMILASE
- Nomes arbitrrios:
* Tripsina e pepsina proteases
10
ENZIMAS NOMENCLATURA
1955 - Comisso de Enzimas (EC) da Unio
Internacional de Bioqumica (IUB) nomear e
classificar.
Cada enzima cdigo com 4 dgitos que
caracteriza o tipo de reao catalisada:
1 dgito - classe
2 dgito - subclasse
3 dgito - sub-subclasse
4 dgito - indica o substrato
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ENZIMAS CLASSIFICAO
Classificao das enzimas segundo a Comisso de
Enzimas.
1. Oxido-redutases
1.1.atuando
1.2.atuando
1.3.atuando
1.4.atuando
1.5.atuando
1.6.atuando
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ENZIMAS CLASSIFICAO
Classificao das enzimas segundo a Comisso de
Enzimas.
4.Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de molculas de gua,
amnia e gs carbnico)
4.1. =C=C=
4.2. =C=O
4.3. =C=N5.Isomerases (transferncia de grupos dentro da mesma molcula para formar ismeros )
5.1.racemases
6.Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre
duas pr-existentes, sempre s custas de energia)
6.1. C-O
6.2. C-S
6.3. C-N
6.4. C-C
13
ENZIMAS CLASSIFICAO
Subclasses
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ENZIMAS NOMENCLATURA
ATP + D-Glicose
ADP + D-Glicose-6-fosfato
E.C. 2.7.1.1
2 - classe - Transferase
7 - subclasse - Fosfotransferases
1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo
hidroxila como receptor
1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato
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ENZIMAS CATALISADORES
Aceleram reaes qumicas
Catalase
H2O2
Ex: Decomposio do H2O2
Condies da Reao
H2O +
O2
Velocidade
Relativa
Sem catalisador
75,2
18,0
Platina
48,9
11,7
2,77 x 104
Enzima Catalase
23,0
5,5
6,51 x 108
16
ENZIMAS CATALISADORES
No so consumidos na reao
H2O2
Catalase
E+S
H2O + O2
E+P
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ENZIMAS CATALISADORES
Atuam em pequenas concentraes
1 molcula de Catalase
decompe
5 000 000 de molculas
de H2O2
pH = 6,8 em 1 min
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ENZIMAS CATALISADORES
Energia
Diferena entre
a energia livre
de S e P
Caminho da Reao
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ENZIMAS
COMPONENTES DA REAO
E+S
ES
Substrato se liga ao
STIO ATIVO
da enzima
P+E
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que participa
Poro protica
Cofator
APOENZIMA
Ativador:ons inorgnicos
que condicionam a ao
cataltica das enzimas. Fe+
Coenzima: molcula
orgnica complexa.NAD+
HOLOENZIMA
Grupamento
prosttico
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ENZIMAS COFATOR
Algumas enzimas que contm ou necessitam
de elementos inorgnicos como cofatores
ENZIMA
COFATOR
PEROXIDASE
Fe+2 ou Fe+3
CATALASE
CITOCROMO OXIDASE
Cu+2
LCOOL DESIDROGENASE
Zn+2
HEXOQUINASE
Mg+2
UREASE
Ni+2
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ENZIMAS COENZIMAS
Maioria deriva de vitaminas hidrossolveis
Classificam-se em:
- transportadoras de hidrognio
- transportadoras de grupos qumicos
Transportadoras de hidrognio
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ENZIMAS COENZIMAS
Transportadoras de grupos qumicos
24
ENZIMAS
LIGAO ENZIMA - SUBSTRATO
25
ENZIMAS
LIGAO ENZIMA - SUBSTRATO
26
ENZIMAS
ATIVIDADE ENZIMTICA
Enzyme Commission: uma unidade (U) de
atividade a quantidade de enzima que catalisa a
transformao de 1 micro mol de substrato ou a
formao de 1 micro mol de produto por minuto.
Expressa: U = micro moles produto/minuto
Atividade especfica = U/mg de protena
Enzima pura, condies que permita a velocidade da
reao seja mxima o substrato [S] de modo a
permitir que toda a enzima [E] [ES].
V = K[E] = K[ES]
27
ENZIMAS
ATIVIDADE ENZIMTICA
28
ENZIMAS
INFLUNCIA DO PH
O efeito do pH sobre a enzima deve-se s variaes
no estado de ionizao dos componentes do sistema
medida que o pH varia.
Enzimas grupos ionizveis, existem em estados
de ionizao.
29
ENZIMAS
INFLUNCIA DO PH
A estabilidade de uma enzima ao pH depende:
- temperatura;
- fora inica;
- natureza qumica do tampo;
- concentrao de ons metlicos contaminantes;
- concentrao de substratos ou cofatores da enzima;
- concentrao da enzima.
ENZIMA
pH TIMO
Pepsina
1,5
Tripsina
7,7
Catalasa
7,6
Arginasa
9,7
Fumarasa
7,8
30
ENZIMAS
INFLUNCIA DA TEMPERATURA
31
ENZIMAS
INFLUNCIA DA TEMPERATURA
Pepsina
31,6
Tripsina
25,5
Urease
20,8
32
ENZIMAS
INFLUNCIA DA TEMPERATURA
Ea Lei de Arrehenius
k Ae Ea / RT
Ea 1
log k
log A
2,3RT T
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ENZIMAS
INFLUNCIA DA [E]
Velocidade de transformao do S em P qtidade
de E.
Desvios da linearidade ocorrem:
- Presena de inibidores na soluo de enzima;
- Presena de substncias txicas;
- Presena de um ativador que dissocia a
enzima;
- Limitaes impostas pelo mtodo de anlise.
Recomenda-se:
- Enzimas com alto grau de pureza;
- Substratos puros;
- Mtodos de anlise confivel.
34
ENZIMAS
INFLUNCIA DA [S]
[S] varia durante o curso da reao medida que S
convertido em P.
Medir Vo = velocidade inicial da reao.
[E] = cte.
vo
Vmax
[S]
35
ENZIMAS
CINTICA ENZIMTICA
Victor Henri (1903): E + S ES
1913
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maud Menten - Pediatra
E+S
K1
K-1
Etapa rpida
ES
Kp
E+P
Etapa lenta
36
ENZIMAS
CINTICA ENZIMTICA
Cintica Enzimtica
37
ENZIMAS
CINTICA ENZIMTICA
v=
v = Vmax [S]
Km
1
Vmax [S]
Km + [S]
v = Vmax
2
Vmax
2
1- [S] Km>>[S]
2- [S] [S]>>Km
3- v = Vmax
Km
[S]
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ENZIMAS
CINTICA ENZIMTICA
Afinidade da enzima ao substrato.
Km depende:
aspectos especficos do mecanismo de reao;
n de passos da reao;
velocidades relativas dos passos individuais.
ENZIMA
SUBSTRATO
Km (mM)
Catalase
H2O2
25
Hexoquinase
ATP
0,4
Quimotripsina
D-Glicose
0,05
D-Frutose
1,5
Gliciltirosinilglicina
108
N-benzoiltirosinamida
2,5
39
ENZIMAS
CINTICA ENZIMTICA
Vmax:
E+S
E+S
K1
K-1
ES
K1
K-1
Vmax = K3[Et]
ES
Kp
E+P
K2
EP
K-2
V
Vmax = Kp[Et]
K3
E+P
Vmax
[2E]
Vmax
[E]
[S]
40
Enzimas
ordem da reao
Quando a formao de
[S] [S] <<Km
P for proporcional [S]
v = Vmax [S]
v = K[S]
a velocidade da reao
Km
de 1a ORDEM
V
Quando a velocidade
da reao independe
da [S] a reao de
ORDEM ZERO
[S] [S]>>Km
[S]
v = Vmax
41
ENZIMAS
MTODOS GRFICOS
Grfico dos Recprocos de Lineweaver-Burk
1
v
Km
Vmax [S]
1
Vmax
1
v
Inclinao =
1
Vmax
-1
Km
1
[S]
Km
Vmax
42
ENZIMAS
MTODOS GRFICOS
Grfico de Eadie-Hofstee
v
vV
K
max
m [S]
Vmax
v
Inclinao =
-Km
Vmax
Km
v
[S]
43
ENZIMAS
MTODOS GRFICOS
Grfico de Hanes-Woolf
K
[S]
1
m
[S]
v
V
V
max
max
[S]
v
Inclinao =
1
Vmax
Km
Vmax
-Km
[S]
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ENZIMAS
MTODOS GRFICOS
Grfico da equao integrada de Michaelis-Menten
[S]o Vmax
2,3
1 ([S]o [S])
log
t
[S]
Km Km
t
Vmax
Km
2,3log[S]o
t
[S]
Inclinao =
-1/Km
Vmax
([S]o-[S])
t
45
ENZIMAS
INIBIO ENZIMTICA
Qualquer substncia que reduz a velocidade de uma
reao enzimtica.
INIBIDORES
REVERSVEIS
COMPETITIVOS
IRREVERSVEIS
NO COMPETITIVOS
INCOMPETITIVOS
46
ENZIMAS
INIBIO COMPETITIVA
Inibidor competitivo concorre com o S pelo sitio ativo da E
livre.
I anlogo no metabolizvel, derivado de um S
verdadeiro, S substituto da E ou um P da reao.
I compostos com estrutura
molecular lembra S
47
ENZIMAS
INIBIO COMPETITIVA
ES
K2
E+P
E+S
K1
I
KI
EI
[ E ][ I ]
KI
[ EI ]
Vmax [ S ]
v
[I ]
K m (1
) [S]
KI
Michaelis-Menten
Km
1
1
[I ] 1
(1
)
Lineweaver-Burk
v Vmax Vmax
K I [S]
48
ENZIMAS
INIBIO COMPETITIVA
1- sem inibidor
2- com inibidor na concentrao [I1]
3- com inibidor na concentrao [I2] > [I1]
49
ENZIMAS
INIBIO NO-COMPETITIVA
50
ENZIMAS
INIBIO NO-COMPETITIVA
E+S
+
I
KS
KI
ES
+
I
K2
KI
EI + S
KS
E+P
[ E ][ I ] [ ES ][ I ]
KI
[ EI ]
[ EIS ]
EIS
Michaelis-Menten
Lineweaver-Burk
Vmax [ S ]
[I ]
[I ]
Km 1
) [ S ](1
)
KI
KI
1 Km
[I ] 1
1
[I ]
(1
)
(1
)
v Vmax
K I [ S ] Vmax
KI
51
ENZIMAS
INIBIO NO-COMPETITIVA
1- sem inibidor
2- com inibidor na concentrao [I1]
3- com inibidor na concentrao [I2] > [I1]
52
ENZIMAS
INIBIO INCOMPETITIVA
Inibidor incompetitivo se liga reversivelmente, em
um stio prprio, ao complexo ES.
I no tem semelhana
estrutural com o S
I favorece a formao do ES
Km e Vmax da enzima
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ENZIMAS
INIBIO INCOMPETITIVA
E+S
KS
ES
+
I
K2
KI
EIS
Michaelis-Menten
Lineweaver-Burk
E+P
[ ES ][ I ]
[ EIS ]
Vmax
[S]
[I ]
1
Ki
v
Km
[S]
[I ]
1
KI
KI
Km 1
1
1
[I ]
(1
)
v Vmax [ S ] Vmax
KI
54
ENZIMAS
INIBIO INCOMPETITIVA
1- sem inibidor.
2- com inibidor na concentrao [I1]
3- com inibidor na concentrao [I2] > [I1]
55
ENZIMAS
INIBIO IRREVERSVEL
I se combina com um grupo funcional, na molcula
da E, que essencial para sua atividade.
Podem promover a destruio do grupo funcional
Forma-se uma ligao COVALENTE entre o I e a E.
Vmax parte da E completamente removida do
sistema e Km permanece a mesma.
E+S
+
I
EI
K1
ES
K2
E+P
56
ENZIMAS
INIBIO IRREVERSVEL
Graficando Vmax vs a quantidade total de E adicionada
ao meio de reao em presena de I.
57
ENZIMAS
ENZIMAS REGULATRIAS
No obedecem a cintica de Michaelis-Menten.
Controlam a etapa limitante em uma cadeia de
reaes enzimticas.
Tem sua atividade cataltica aumentada ou diminuda
em resposta a determinados sinais, molculas
sinalizadoras (pequenos metablicos ou cofatores).
Classes de enzimas reguladoras:
Enzimas alostricas;
Enzimas reguladas pela modificao covalente
reversvel.
58
ENZIMAS
ENZIMAS REGULATRIAS
Enzimas alostricas
Funcionam atravs da ligao no-covalente e reversvel
de um metablito regulador chamado modulador;
Moduladores podem ser inibidores ou ativadores;
So maiores e mais complexas, possuem duas ou mais
cadeias polipeptdicas.
Enzimas reguladas pela modificao covalente
reversvel
Grupos qumicos so ligados covalentemente e
removidos da enzima reguladora por enzimas , podem
ser: fosfato, adenosina monofosfato, grupos metil, etc.
59
ENZIMAS
ENZIMAS REGULATRIAS
60
ENZIMAS -
IMOBILIZADAS
Imobilizadas
Instabilidade
Reutilizao
Rpida perda da
atividade cataltica
Maior estabilidade
(faixas mais amplas de
pH e temperatura)
No podem ser
recuperadas
Menor interferncia de
inibidores e/ou
ativadores
61
ENZIMAS -
IMOBILIZADAS
62
ENZIMAS -
IMOBILIZADAS
63
ENZIMAS -
IMOBILIZADAS
64
ENZIMAS -
IMOBILIZADAS
65
ENZIMAS -
IMOBILIZADAS
Medida da atividade:
Atividade da enzima imobilizada mais fraca que
a das enzima nativa, mas a estabilidade maior.
Influencia das condies operacionais:
pH e temperatura desnaturao parcial ou
total da protena;
imobilizada resistem melhor a variaes de pH
e tratamentos trmicos;
Obs: origem da enzima, suporte utilizado e mtodo de fixao
66
ENZIMAS -
IMOBILIZADAS
Aplicaes analticas:
Facilita automatizao das cadeias de dosagem e
simplifica as manipulaes.
Biossensores:
Imobilizao de colinesterase e anticorpos
sobre cristal piezeltrico utilizadas na
deteco de pesticidas organofosforados;
Reatores para anlise cromatogrfica;
Kits para titulaes e imunoensaios.
67
ENZIMAS -
IMOBILIZADAS
Indstria de alimentos:
Glicose isomerase fixada para a produo de
xaropes com alto teor de frutose;
Celulase Converso de celulose em acares
solveis;
Imobilizao de fermento de po (Sacharomices
cerevisae) lcoois enantiomericamente puros.
Uso Industrial:
Fonte para produo de penicilinas sintticas.
68
ENZIMAS -
IMOBILIZADAS
Lipases imobilizadas:
Imobilizadas em organo-gel utilizadas na esterificao
do cido olico com n-pentanol;
Imobilizadas em carvo de coco, bauxita e gel de gar
utilizadas na transformao de leo de soja em
biodisel.
Aplicaes na medicina:
Hidrogel contendo enzimas imobilizadas Substrato
presente - converso enzimtica - produto muda a
conformao do hidrogel liberao da droga.
69
ENZIMAS -
IMOBILIZADAS
Em desenvolvimento:
Estudos de filtros que utilizam enzimas
imobilizadas na superfcie do meio filtrante para o
tratamento do ar dos ambientes.
Recentes avanos na imobilizao de enzimas por
argilas, utilizadas em bioremediao.
Estudos em desenvolvimento: imobilizao,
estabilizao e aplicao da enzima esterase, de
rim de porco, na sntese de produtos de interesse
farmacutico.
70
ENZIMAS APLICAES
Permitem s indstrias usarem processos mais
econmicos, diminuindo o consumo de energia e
recursos; mais confiveis e que poluem menos.
So eficientes;
Muito especficas;
Permite produo segura e ambientalmente amigvel.
ENZIMA
Origem vegetal
Origem animal
Origem microbiana
FONTE
APLICAO
Papana
mamo
Bromelina
abacaxi
Diastase
malte
Pepsina
mucosa gstrica
suno
Lipase
Candida rugosa
Panificao, xarope
Amaciamento de carne
Tratamento de efluentes
71
ENZIMAS APLICAES
Proteases
Leite: na preparao do leite de soja.
Carnes e Peixes: recuperao de protenas do osso
ou espinha.
Vinhos: clarificao.
Queijo: coagulao da casena.
72
ENZIMAS APLICAES
Lactase
Sorvete: preveno da cristalizao da lactose.
Leite: estabilizao das protenas do leite em
leites congelados por remoo da lactose.
Hidrlise da lactose, permitindo o uso por
adultos deficientes na lactase intestinal e em
crianas com deficincia em lactase congnita.
Rao: converso da galactose em lactose e
glicose.
73
ENZIMAS APLICAES
-amilase
Fermentados: converso do amido a maltose
por fermentao. Remoo da turbidez do amido
Cereais: converso do amido a dextrinas e
maltose.
Chocolate/cacau: liquefao do amido
74
ENZIMAS APLICAES
Peroxidase
Deteriorao - Frutas: contribui na reao de
escurecimento.
Polifenoloxidase
Ch/Caf: desenvolvimento do escurecimento
durante o amadurecimento e fermentao.
Deteriorao - Frutas e Vegetais: reao de
escurecimento e perda de vitaminas.
75
ENZIMAS APLICAES
Enzimas utilizadas em raes para aves.
Enzima
Substrato
Efeitos
Xilanase
Arabinoxilanas
Glucanases
-glucanos
Pectinases
Pectinas
Celulases
Celulose
Proteases
Protenas
Amilases
Amido
Fitase
cido ftico
Galactosidases
Galactosdios
Remoo de Galactosdios
Lipases
Lipdios e
cidos graxos
76
ENZIMAS APLICAES
Tratamento de efluentes
Preocupao ambiental desencadeou uma
77
ENZIMAS APLICAES
Enzimas utilizadas em tratamento de efluentes.
Enzima e fonte
Poluentes e efluentes
Indstria de tinta
Polifosfatase e Fosfotransferase
Naftaleno-dioxigenase
Remoo de naftaleno
(Candida rugosa)
(pncreas de porco)
78
ENZIMAS APLICAES
Industria de lcool;
Industria de detergentes;
Industria txtil;
Industria de papel e celulose;
Curtumes;
Produo de cido ctrico, cido glutmico, insulina,
vacinas, esterodes, vitaminas e antibiticos;
Bioremediao: de polmeros, de hidrocarbonetos e
clorados.
79
ENZIMAS APLICAES
Aplicao da Lipase no tratamento de guas
residurias com elevados teores de lipdeos
JUSTIFICATIVA
80
ENZIMAS APLICAES
OBJETIVO
81
ENZIMAS APLICAES
MATERIAIS E MTODOS
(Va Vb ).M.106
U
t.m
(moles/mg.min)
82
ENZIMAS APLICAES
RESULTADOS
83
ENZIMAS APLICAES
RESULTADOS
84
ENZIMAS APLICAES
RESULTADOS
85
ENZIMAS APLICAES
RESULTADOS
86
ENZIMAS APLICAES
RESULTADOS
87
ENZIMAS APLICAES
RESULTADOS
88
ENZIMAS APLICAES
RESULTADOS
Influncia da concentrao de substrato na atividade
hidroltica das lipase LKM e LNU
900
Atividade (U)
800
700
600
500
300
10
20
30
40
concentrao (%)
50
60