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Estremofili:

Gli Organismi
dalla Inesplorata Biodiversit
alla Biotecnologia del Futuro
Mos Rossi
Dipartimento di Biologia Strutturale e
Funzionale
Universit Federico II Napoli
Istituto di Biochimica delle Proteine
CNR Napoli

In oltre 3.8 miliardi di anni di vita sulla terra, i


microrganismi
hanno
avuto
uninfluenza
determinante
sullequilibrio
ecologico
e
geochimico del pianeta, sono testimoni della
storia dellevoluzione biologica e agiscono da
veri e propri biosensori della Natura.
Infatti, le attivit metaboliche, le dinamiche
evolutive e i processi ecologici delle popolazioni
microbiche hanno effetti sui flussi di energia e
materia nel mare, sulla terra e nellatmosfera, e
perfino sui cambiamenti globali del clima. I
microrganismi catturano e processano lenergia
e guidano i maggiori cicli degli elementi.

Grazie ai progressi tecnologici e alla convergenza


di microbiologia, ecologia, genomica, geologia e
oceanografia, lo studio dei microrganismi ha
avuto negli ultimi anni uno sviluppo esplosivo ed
ha

permesso

di

valutare

la

diversit

limportanza dellattivit microbica nelle nicchie


ecologiche pi remote.
Ma quali sono i limiti della biosfera microbica?

Una visione antropocentrica dellUniverso ha fatto ritenere, per il


passato, che le condizioni chimiche e fisiche che permettono ai viventi
di crescere e riprodursi siano comprese tra le temperature di 10 e 40C,
comprendano soluzioni saline non superiori a quelle dellacqua del mare
e abbiano una moderata acidit o alcalinit alla pressione atmosferica.

Lesplorazione di habitat estremi considerati, un tempo, al di fuori della biosfera,


ha rivelato che essi sono ricchi di vita. Sono stati trovati organismi in grado di
crescere e riprodursi soltanto in condizioni ritenute non compatibili con la vita.

Tali scoperte hanno rivoluzionato la concezione dei limiti di temperatura, di


salinit, di acidit o alcalinit, di pressione che consentono la vita stessa.

Questi microrganismi sono stati denominati estremofili e sono stati


trovati dovunque siano stati cercati.

CATALOGAZIONE DEI
MICRORGANISMI
Mesofili: temperature moderate
Termofili / Ipertermofili: alte temperature
Acidofili / Alcalofili: condizioni acide/
basiche
Alofili: alte concentrazioni saline
Psicrofili: basse temperature
Barofili: alte pressioni

Temperature limits for life

The highest and lowest temperature for each major taxon is given. Archaea are in red, Bacteria in blue, algae in
light green, fungi in brown, protozoa in yellow, plants in dark green and animals in purple.

Habitats degli ipertermofili terrestri

Hydrothermal sites on Earth


Solfataric fields

Hydrothermal vents
Marine Black smokers

Greetings from Vulcano Solfatara


Pozzuoli (Napoli) - Italy

Pozze di fango
bollente

Fumarola

S. solfataricus
home

Sorgenti calde

Sulfolobussolfataricus80C

Archaeoglobusfulgidus80C

Black smokers

Pyrodictiumoccultum110C

Pyrococcusfuriosus90C

Lost city (white smokers)

Methanopyruskandleri90C,2000m

- T= 40-90 C
- pH molto basico
- camini di carbonato bianco
- Archaea metanogeni

Proteobacteria0C,

Proteobacteria0C,3000m

FerroplasmaacidophilumpH1

Bacillussp.pH10.5

Halobacterium salinarium
20% NaCl

Halobacterium japonicum
30% NaCl

Methanobacter4060C

La recente pubblicazione della sequenza del genoma del pi


abbondante e diffuso batterio marino il Pelagibacter ubique ci
ricorda il vasto universo microbiologico che ancora deve essere
esplorato.
Questo genoma, di 1.3 milioni di coppie di basi, il pi piccolo di
tutti gli organismi noti viventi non parassiti sul pianeta e la sua
altamente essenziale sequenza genica gli d una grande
competizione per riprodursi negli ambienti in cui la
concentrazione dei nutrienti bassa come nel mar dei Sargassi.
Analisi di DNA di carotaggi a differenti profondit sotto il Pacifico
hanno indicato la presenza di attive comunit di microrganismi e
cambiamenti nella biodiversit microbica che accoppiata alle
variazioni nella composizione chimica dei sedimenti.

Nel 2002 fu scoperto un nuovo archeon ipertermofilo


chiamato Nanoarcheum equitans che vive nei camini
sottomarini a 90C.
Le sue cellule colorate di rosso misurano solo 400
nm e crescono attaccate a un altro archeon del
genere Ignicoccus.

Il genoma del nanobatterio di 0.49 milioni di coppie


di basi con 552 sequenze di DNA codificanti di circa
800 paia di basi per gene.

I meccanismi che consentono il mantenimento delle funzioni


cellulari in condizioni di vita estrema sono oggetto di intensi
studi.
Importanti
innovazioni
tecnologiche
nei
metodi
di
campionamento e filogenesi molecolare, che non richiedono la
coltivazione dei microrganismi, hanno reso possibile una
valutazione della diversit ed importanza dellattivit microbica
nelle nicchie ecologiche pi remote.
Tali studi hanno chiarito che, per esempio, il sottosuolo sia
terrestre che marino, rappresenta lhabitat di elezione di miliardi
di microbi che costituiscono circa il 50%della biomassa totale
della terra.
Le dimensioni di questi organismi sono di circa 500-600 nm.
Recentemente sono stati scoperti organismi che per le loro
dimensioni sembrano sfidare le leggi della biologia.
I nanoarchea ed i nanobatteri hanno dimensioni paragonabili o
addirittura inferiori ad alcuni virus.

Un po di numeri: dimensioni
Parvovirus
(ilpipiccolovirus)
20nm

Nanoarchaeumequitans
(ilpipiccoloarchaeon)

400nm

Pelagibacterubique
(ilbatteriopiabbondante)
500nm

Nanobacterium
(ilpipiccolobatterio)
20150nm

Mimivirus
(ilpigrandevirus)
400nm

Escherichiacoli
20006000nm

Un po di numeri
Numero e biomassa di procarioti nel mondo
HABITAT

Numero di cellule
(x1028 )

Contenuto in carbonio della


biomassa (x1015 g)

Acque

12

2.2

Sottosuolo oceanico

355

303

Suolo

26

26

Sottosuolo terrestre

25-250

25-215

Totale

415-640

353-546

I procarioti costituiscono circa met del protoplasma dei


viventi .
Contengono, rispetto alle piante:
- il 60% del C
- 10 volte pi N e P

Un po di numeri
Abbondanza dei procarioti in differenti ecosistemi
HABITAT

Numero di cellule

Acqua di mare (superficiale)

5x105 cellule/ml

Acqua di mare (profonda)

5x104 cellule/ml

Acqua dolce

1x106 cellule/ml

Suolo

1x107 cellule/g

Rumine

1x1015 cellule/individuo

Intestino umano

1x1015 cellule/individuo

Lapparato digerente animale uno degli ecosistemi pi popolati da


microrganismi

Un po di numeri
Coltivabilit dei procarioti da differenti ecosistemi
HABITAT

Coltivabilit (% di specie
coltivabili sul totale)

Acqua di mare

0.001-0.1

Fiumi

0.25

Laghi

0.1-1

Fanghi attivati

1-15

Sedimenti

0.25

Suolo

0.3

I TRE DOMINI DEI VIVENTI

Bacteria

Archaea

Eucarya

Sulla scala temporale, la comparsa dei procarioti


(prima Archaea e poi Batteri) ha preceduto di molto
quella degli Eucarioti

Tra tutti gli


organismi
viventi, i
procarioti
(sia Batteri
che Archaea)
presentano la
maggiore
diversit
genetica e
metabolica

Tecniche classiche per lisolamento di specie microbiche


Campioni da differenti habitats

Differenti terreni di coltura

Tecniche classiche per lidentificazione di specie microbiche

E noto che solo una minima parte dei microrganismi


stata identificata e si stima che solo circa 1% sia
coltivabile.
Per ovviare a questa limitazione, si sviluppata la
Metagenomica, cio il sequenziamento dei genomi
mediante estrazione diretta o clonaggio del DNA da
comunit di microrganismi estratti dal suolo o da
filtrati di acqua di mare.
La metagenomica, sfruttando la Biodiversit, ha anche
una grande potenzialit dimpatto sulla ricerca
industriale a tutti i livelli per lo sviluppo di nuove
molecole e di tecnologie rispettose dei problemi
ambientali.

La metagenomica, sfruttando la Biodiversit, ha anche una grande


potenzialit dimpatto sulla ricerca industriale per lo sviluppo di
nuove molecole e di tecnologie rispettose dei problemi ambientali.

Approcci high throughput per lo studio


della biodiversit molecolare dei microganismi
Campione ambientale

COLTIVAZIONE

Strategie Selettive
di isolamento

METAGENOMICA

Estrazione del DNA


Costruzione di una libreria

Analisi delle sequenze

Con questa tecnologia il gruppo di Craig Venter, che


dopo il sequenziamento del genoma umano, ha
fondato
lInstitute
for
Biological
Energies
Alternatives, alla ricerca di microrganismi che
producono idrogeno, ha isolato da filtrati di acqua di
mare migliaia di nuove specie batteriche e milioni di
geni sconosciuti.
Inoltre, grazie alle tecniche di sequenziamento
ultraveloce su larga scala, stato finora sequenziato
il genoma completo di centinaia di microganismi
marini.
Il gruppo di Venter sta ora affrontando unaltra sfida
che ha sollevato molte discussioni ed opinioni
controverse: creare la vita e utilizzarla per produrre
energia pulita.

Lidea di creare un microrganismo sintetico con un corredo genico


minimo, a cui aggiungere geni per la produzione di energia pulita.
Il Gruppo di Craig Venter sta cercando di introdurre in questo
microbo, creato in laboratorio, le sequenze dei geni delle vie
metaboliche per degradare la cellulosa fino alla produzione di
etanolo, partendo da materiale vegetale di scarto, senza aggravio per
lagricoltura, come invece accade con gli attuali metodi che utilizzano
mais o grano.

Scoperte attese dallo studio


della biodiversit molecolare dei microrganismi
Inventario degli organismi viventi e ricostruzione della storia
dellevoluzione.
Informazioni sullorigine della vita e sulla possibilit che la vita esista al
di fuori della Terra (esobiologia).
Dettagli dei meccanismi biochimici, genetici e fisiologici
delladattamento a diversi ambienti.
Identificazione di nuovi metaboliti ed enzimi per applicazioni in campo
medico, agroalimentare ed industriale.
Sviluppo di sistemi genetici per utilizzare i microrganismi come
fabbriche cellulari.

Biodiversit e Biotecnologie
Nelle Biotecnologie, sono le caratteristiche dei sistemi
biologici usati, in relazione alla loro specificit funzionale e
stabilit, a fissare i limiti operazionali di un processo.
La scoperta di nuovi organismi che vivono in maniera ottimale
in ambienti particolari, con il conseguente adattamento delle
biomolecole indispensabili alla loro vita, allargano i limiti delle
condizioni operative nellindustria sia per implementare
processi tradizionali, sia per disegnarne nuovi per prodotti
innovativi.
Un approccio importante lutilizzo della biodiversit poich la
diversit dei microrganismi, le molecole che contengono ed i
processi che essi svolgono sono realmente immensi.

I risultati ottenuti negli ultimi anni dallo studio degli


enzimi isolati da microrganismi estremofili hanno
generato approcci innovativi per la comprensione del
rapporto tra struttura e funzione delle proteine e portato
al convincimento che la loro utilizzazione nei processi
industriali apre una nuova era nel campo delle
Biotecnologie.
Si sono trovati enzimi stabili ed attivi da pH 1 a 11 a
temperature tra 0C e oltre 100C, a elevate
concentrazioni saline, nei solventi organici, nei
detergenti, etc.
Si prevede che il loro utilizzo potr ridurre la distanza
tra processi chimici e biologici.

ENZIMI
Gli enzimi da ipertermofili sono termostabili e attivi ad alte
temperature (termoattivi)
geneticamente codificate

le

loro

propriet

sono

Sono stabili e spesso attivi in solventi organici


Sono generalmente stabili verso i comuni denaturanti delle
proteine (urea, guaridinio idrocloruro, SDS, etc.)
Hanno unattivit ottimale ad una temperatura vicina a quella
di crescita ottimale dellorganismo da cui derivano
Sono esempi naturali di enzimi termostabili, termofilici e
resistenti ai solventi e possono essere usati come modelli
naturali per disegnare e costruire proteine con nuove
propriet.

Propriet richieste per il


processo
Produzione di una
libreria di enzimi

Enzimi candidati

Evoluzione in vitro
ingegneria enzimatica
Enzimi con le
propriet richieste

Applicazione degli
enzimi nei processi
biocatalitici

screening secondario

Enzimi da estremofili
FONTE

CRESCITA

ENZIM I

APPLICAZIONI

Termofili/

60-80
C (termofili)
80 C
(ipertermofili)

Proteasi

Detergenti, industria alimentare, della birra,


panificazione
Degradazione di amido, cellulosa, pectina,
chitina, industria tessile e della carta
Detergenti, reazioni stereo-specifiche,
biosintesi organica
PCR
Reazioni di ossido-riduzione

ipertermofili

Glicosil idrolasi
Lipasi, esterasi
DNA polimerasi
Deidrogenasi

Psicrofili

15 C

Proteasi
Glicosil idrolasi
Lipasi

Detergenti, industria alimentare


Degradazione di amido, cellulosa, pectina,
chitina, industria tessile e della carta
Detergenti, industria alimentare e cosmetica

Alofili

2-5 M NaCl

Proteasi
Deidrogenasi

Produzione di peptidi
Biocatalisi in solventi organici

Alcalofili

pH 9

Proteasi, cellulasi

Detergenti, industria alimentare

Acidofili

pH 3

Amilasi
Proteasi, cellulasi
Ossidasi

Degradazione di amido
industria alimentare
Desulfurizzazione del carbone

Piezofili

fino a 130 MPa

Idrolasi
Vari

Industria alimentare
Produzione di antibiotici

LAPOLYMERASECHAINREACTION(PCR)
L amplificazione dei frammenti di DNA con questa tecnologia ha portato ad una
rapida espansione della Conoscenza nelle scienze della vita, in particolare nella
biologia molecolare e cellulare, nell ingegneria genetica e nelle biotecnologie.

La Polymerase Chain Reaction (PCR)


Una molecola

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Consiglio Nazionale delle Ricerche


Institute of Protein Biochemistry

La Polymerase Chain Reaction (PCR)


La scoperta di una nuova polimerasi dal batterio termofilo Thermus aquaticus
elimin il problema dellaggiunta dellenzima ad ogni ciclo dopo il passo dii
denaturazione, portando ad un rapido sviluppo della tecnica PCR .
Successivamante, dagli Archaea sono state isolate e portate sul mercato varie
DNA polimerasi che differiscono dalla Taq in quanto:
le DNA polimerasi da Archaea posseggono attivit proofreading , mancano
dellassociata attivit esonucleasica 3-5, anche se hanno una processivit
limitata in vitro;
Il problema della bassa processivit stato superato con lisolamento di una
DNA polimerasi archeale da Thermococcus kodakaraensis, che mostra velocit di
estensione pi elevate (106-138 s-1) con bassi errori ed alta processivit.

Consiglio Nazionale delle Ricerche


Institute of Protein Biochemistry

Idrolisi enzimatica dellamido


O

OH
O

HO

(1,4)

amilosio

OH

OH
O

HO

OH

OH

(1,4)

amilopectina

HO

O
OH

O
O

(1,4)

O
O

(1,4)

(1,4)

(1,6)

OH

(1,4)

O
O

1 -amilasi
2 -amilasi
3 pullulanasi

glucoamilasi

glucosio

Consiglio Nazionale delle Ricerche


Institute of Protein Biochemistry

Liquefazione e saccarificazione dellamido (starch)


LIQUEFACTION
Starch slurry
35% dry solids (DS), pH 6.5
Ca++ > 40 ppm

-amylase

Gelatinization
103 - 105C; 3 - 7 min

Dextrine Syrup
8-15% DE

Dextrinization
95C; 1 - 3 hrs
fungal
-amylase

Maltose syrup

Lamido insolubile in acqua si rigonfia e gelatinizza alle


alte temperature, permettendo lattacco delle amilasi.
Lutilizzo di una alfa-amilasi termostabile ed attiva alle
alte temperature permette che il processo di
gelatinizzaziene
e
saccarificazione
avvenga
contemporaneamente con riduzione dei costi e
dellimpatto ambientale.

glucoamylase

SACCHARIFICATION
60C; pH 4.2 - 4.5; 48 hrs

Glucose syrup
95-96% DE

Consiglio Nazionale delle Ricerche


Institute of Protein Biochemistry

Produzione di High Fructose Corn Syrup


Lo sciroppo di Glucosio pu essere venduto in forma liquida o cristallizato per varie applicazioni.
La maggior parte dello sciroppo di glucosio negli USA convertito nello high fructose corn
syrup (HFCS).
Paragone del potere dolcificante
Saccarosio
Glucosio
Fruttosio
Maltosio
Lattosio
Saccarina
Aspartame

100
70
130
40
16
30,000
20,000

Una soluzione al 42% di fruttosio ha lo stesso potere dolcificante di una al 100% di saccarosio
xylose
isomerase

xylose

ma ad alta temperatura
(90-95 C)

glucose

xylulose
xylose
isomerase

fructose

SISTEMA BIOMIMETICO ENZIMATICO PER LA


CATTURA DELLA CO2

Il
crescente
aumento
nellatmosfera
della
concentrazione della anidride carbonica (CO2)
prodotta dalle attivit antropiche ritenuta una delle
principali cause dei cambiamenti climatici della terra.
Pertanto lo sviluppo e limpiego di tecnologie per
ridurne la concentrazione, mediante cattura e
stoccaggio, avranno un ruolo essenziale a livello
internazionale per poter produrre lenergia necessaria
allo sviluppo di ogni paese riducendo il danno
ambientale.

DIMENSIONE DEL PROBLEMA

Prendiamo in considerazione una centrale di 300 MW che utilizza


carbone e d energia ad una cittadina di circa 10.000 abitanti,

Essa brucia circa 125 tonnellate di carbone per ora, circa 3000 T
al giorno.

Produce circa 290 tonnellate di CO2 per ora (2,32 T di CO2 per T di
carbone) cio 6960 T al giorno.

Da questi dati si evince che la quantit di CO 2 da considerare


molto grande e che, se si sequestrasse la CO 2 come carbonato di
Calcio, si produrrebbero 666 T di sale per ora e circa 16.000 T per
giorno.

Un automobile di cilindrata media produce circa 130 gr di C0 2 per Km


percorso. Ogni 100 Km unauto produce 13 Kg di C0 2.

Sorge la necessit di catturare e sequestrare la CO2 in loco


utilizzando opportune tecnologie e associando la produzione di
energia alla cattura della CO2. .
La tecnologia pi sviluppata sembra essere quella
dellassorbimento chimico della CO2 su alcanolammine, seguite
dallo stripping con vapore, per produrre gas concentrato con
successiva sua compressione nella forma liquida che pu essere
portato a un sito di sequestro generalmente geologico o marino.
Comunque questo processo costoso ed problematico sia il
sequestro geologico che quello marino anche per ragioni
ecologiche e di sicurezza.
Il sequestro della CO2 in forma di sale per uno stoccaggio di
lunga durata molto interessante in quanto i minerali carbonato,
tipo calcite, dolomite, aragonite etc rappresentano la pi grande
riserva di CO2 della terra e la geologia dimostra che se ne
possono conservare indefinitamente grandi quantit.

Ho un progetto con lENEL per sviluppare un sistema biomimetico per il


sequestro della CO2 prodotta in impianti di combustione.
Abbiamo isolato da organismi termofili, anidrasi carboniche stabili , che
con la loro specificit, selezionano la CO2 dagli altri gas e ne catalizzano
la velocit di idratazione per la successiva fissazione in minerali stabili
con dei contro ioni di sali, utilizzando varie sorgenti saline di scarto o
acqua di mare.
Lanidrasi carbonica un metallo-enzima antico molto diffuso anche nei
procarioti. Fisiologicamente lanidrasi carbonica facilita la rimozione della
CO2 dal corpo dei mammiferi.
E uno degli enzimi pi efficienti conosciuti. Infatti una molecola di
enzima idrata circa 1.000.000 di molecole di CO2 per secondo.
E considerato un enzima vicino alla perfezione.
Nella Figura riportato il meccanismo di azione dellenzima e il principio
per lutilizzo dellenzima stesso immobilizzato nel processo.

Anidrasi carbonica
CO2 + H2O

HCO3- + H+

Tale sistema biomimetico offre indubbi vantaggi in quanto il processo effettuato


in soluzione acquosa, specifico per il sequestro della CO2, ambientalmente
compatibile e la concentrazione della CO2 e il trasporto sono relativamente poco
costosi.

Biodiversity

Gene library

Discovery

Screen

Recover clone

Evolution
Enzyme

Small molecule

Production