El virus de la hepatitis B regula la apoptosis y la tumorognesis a travs de la va

del TGF-B (FACTOR DE TRANSFORMACIN DE CRECIMIENTO BETA) por microRNA

15a y Smad7
Magda Lorena Barrios Villamizar
COD 2110553
Laura Marcela Villarreal Becerra
COD 2121343

Introduccin
Infeccin por el HBV es un
problema importante de salud
pblica 350 millones de
personas infectadas a nivel
mundial de forma crnica

HBV es un virus envuelto,

hebra doble de DNA parcial,
genoma 3,2 kb

mRNA codifica: polimerasa,

core, envoltura, pre S1, S2 y
protena X

Prot X promotor de
tumorognesis

HBV inhibe la apoptosis

mediante miR15 y Bcl-2?

Protenas Smad son seal clave

en el rol de TGF B1

Smad7 inhibe TGF-B

La va de sealizacin por TGFB - hepatocarcinoma celular

No se conoce muy bien el

mecanismo de HBV para
producir HCC

Materiales y mtodos
Tejidos hepticos
de humanos con
HCC

Ratones
transgnicos con
HBV cepa BALB/C

Plsmidos
construidos con
Smad7 y Smad2

Anticuerpos
derivados de cabra
y conejo y
reactivos

Cultivos celulares
y tcnicas de
transfeccin

Peroxidasa de rbano
picante, etc

Extraccin de RNA
y PCR en tiempo
real

Inmunotransferenc
ia

Inmunofluorescenc
ia

Ensayos de
actividad de la
caspasa 3/7

Construccin de
las lneas celulares
HepG2 shSmad7#

Anlisis de la
viabilidad celular

Evaluacin de la
tumorognesis

Citometra de flujo

Resultados
MiR-15a regula la expression de Smad7 utilizando
como blanco su porcin 3UTR.

Los niveles de mRNA de Smad7 fueron

significativamente ms bajos en las clulas
HepG2 transfectadas con miR15a.

Los niveles proteicos de Smad7 fueron

significativamente ms bajos en las clulas
con miR15a

Resultados
MiR-15a regula la expresin de Smad7 utilizando
como blanco su porcin 3UTR.

Al examinarse el nivel de afinidad de

mIR15a sobre Smad7 se encontr la
existencia de una regin complementaria
en la seccin 3UTR del mRNA de Smad7

Al aplicar la tcnica de
luciferasa para estimar
la actividad de Smad7,
se encontr que en las
clulas con mIR15a los
niveles de Smad7
disminuan tanto su
mRNA como la
protena producida

Al evaluarse la complementariedad con

una cadena Smad7 mutante, donde se
observaron alteraciones en el sitio de
unin

Resultados
El HBV regula la expresin de Smad7 y miR15a en
HBV es capaz de bajar los niveles de
los hepatocitos
mIR15a?

Se confirm que los niveles de

miR15a fueron ms bajos en las
clulas transgnicas HepG2C5 y
HepG24D14 con HBV

Se analizaron los niveles de mRNA de Smad6 y Smad 7

as como sus protenas sintetizadas en las clulas
HepG2, HepG2C5 y HepG24D14.
Se encontr que los niveles de mRNA de Smad7 y
consecuentemente los de protena codificada fueron
ms altas en las clulas , HepG2C5 y HepG24D14 a

Resultados
El HBV regula la expresin de Smad7 y miR15a en
los hepatocitos

Se transfectaron clulas HepG2 y L02 con pHBV1.3 o con pHBV1.3mut para analizar las
cantidades de mRNA y protena de Smad7.
El nivel de mRNA y protena de Smad7 en las clulas con pHBV1.3 estuvieron ms
elevados que en las que tenan la variedad mutante del virus o las clulas control

Resultados
HBV regula la expresin de Smad7 por actuacin
sobre miR15a (ensayos en vivo)
Existe una correlacin
negativa entre los
niveles de miR15a y
mRNA de Smad 7

Se examin la cantidad de mRNA de

Smad7 en ratones que se infectaron
con HBV
La cantidad relativa de mRNA de
Smad7 en el tejido heptico de los

Se quiso evaluar la relacin entre

mIR15a y mRNA de Smad7 en tejido
heptico de pacientes con HCC con
HBV crnica

Resultados
HBV regula la expresin de Smad7 por actuacin
sobre miR15a (ensayos en vivo) Se compar el nivel de
Smad 7 en tejidos
tumorales y tejidos
adyacentes (5
muestras).

Se evidenci que los

niveles de Smad7 en el
tejido tumoral fue ms
alto que en los tejidos
adyacentes

Existe una correlacin positiva entre

los niveles de mRNA de HBV y el
mRNA Smad7 en el tejido heptico
de pacientes con HCC

De igual manera se
evidenci que el nivel
de HBV era mas
elevado en el tejido
tumoral que en el
tejido adyacente

Resultados
mIR15a realza la sealizacin de TGF-B por
regulacin
de Smad7.
Para evidenciar
que Smad7 acta como un

Se encontr que la imitacin

de miR15a realz la actividad
de TGF-B
El inhibidor de miR15a inhibi
la actividad de TGF-B

antagonista de TGF-B (por lo tanto tambin baja los

niveles de Smad2), se transfectaron clulas HepG2
con un plsmido pFLAGmv2Smad7 y se trataron con
TGF-B. Se analiz la cantidad total de Smad 2 a nivel
celular y nuclear por inmunotransferencia
Los datos mostraron que la
cantidad de Smad2 a nivel
nuclear en las clulas que
sobrexpresaban Smad7 fue
mas baja, mientras que la
cantidad a nivel total (NO
NUCLEAR) permaneci
similar para los grupos
evaluados

Resultados
mIR15a realza la sealizacin de TGF-B por regulacin de Smad7.
Se examin la cantidad
de Smad2 en clulas
transfectadas con la
imitacin de miR15a.

El miR15a realz la
traslocacin de Smad2
a nivel nuclear a
travs de la regulacin
de Smad7

En otro ensayo se
mir la relacin
miR15a Smad 7

La sobreexpresin de
Smad7 contrarrest
el efecto de miR15a
sobre la traslocacin
nuclear de Smad2

Resultados
HBV inhibe la sealizacin de TGF-B por medio de la regulacin de miR15a

Las clulas HepG2 fueron transfectadas con

pHBV1.3 o pHBV1.3mut y por medio de ensayos
de luciferasa se determin la actividad de TGF-B.

La actividad de la
luciferasa en las
clulas transfectadas
con pHBV1.3 fue
significativamente
ms reducida, es
decir disminua la
actividad del TGFB

De manera consistente, la
cantidad de Smad 2 en el
ncleo se encontr
significativamente reducida
en las clulas transfectadas
con pHBV1.3

Resultados
HBV inhibe la sealizacin de TGF-B por medio de la regulacin de miR15a
Para determinar como el HBV
interfiere en los niveles de
Smad7 a travs de miR15a, se
transfectaron clulas HepG2
con pHBV1.3 CON o SIN una
imitacin de miR15a

La cantidad de Smad2 en el
ncleo fue ms bajo para las
clulas contransfectadas con
pHBV1.3, pero en las que
adems tenan miR15a, la
cantidad de Smad2 volvi a la
normalidad

miR15a contrarresta los efectos del

virus sobre Smad7, adems juega
Los niveles de Smad7
un papel
importante para mantener
incrementaron en las
clulasniveles
transfectadas
los
de Smad2

con pHBV1.3 PERO

VOLVIERON A SUS
NIVELES ORIGINALES
cuando tambin se
Los niveles de Smad7exponan a miR15a
incrementaron en las
clulas transfectadas
con pHBV1.3

Resultados
HBV inhibe la sealizacin de TGF-B por medio de la regulacin de miR15a

Tambin se determin la cantidad de Smad2 fosforilado en clulas HepG2

cotransfectadas con pHBV1.3 y pCMVMycSmad2
El nivel de Smad2
fosforilado en las clulas
transfectadas con pHBV1.3
y pCMVMycSmad2 fue
mucho mas bajo que en las
clulas que solo tenan
pCMVMycSmad2

Resultados
HBV genera clulas HepG2 resistentes a TGF-B1
Primero se evalu como TGFB induce la apoptosis en las
clulas HepG2 por escisin
del fragmento PARP-1

Se compar el nivel de
escisin de PARP-1 en las
diferentes clulas segn se
trataran o no con TGF-B

Se realiz el ensayo con

HepG2 con pHBV1.3 y su
variante mutante

HepG2C5 y HepG24D14
resistente a apoptosis por
TGFB

La escisin PARP-1 en las

clulas HepG2G5 y HepG2D414
era mucho ms dbil que en las
HepG2

La escisin PARP-1 fue

reducida en las clulas
pHBV1.3

Resultados
HBV genera clulas HepG2 resistentes a TGF-B1
Se evalu en las clulas HepG2 y L02 la actividad
de la Caspasa 3/7, tratndolas con HBV y su
variedad mutante

En las clulas cotransfectadas con

pHBV1.3 y miR15a la escisin
PARP-1 fue recuperada a cierto
nivel
El nivel de actividad de la caspasa 3/7 en las
clulas transfectadas con pHBV1.3 fue ms bajo
que en las clulas control o en las que tenan el

Resultados
HBV genera clulas HepG2 resistentes a TGF-B1
Por citometra de flujo
se realiz un
monitoreo de las
clulas apoptticas
Despus del
tratamiento con
TGFB1, el porcentaje
de clulas apoptticas
en las con pHBV1.3
fue hasta 3 veces ms
bajo que en las clulas
control

HBV puede inhibir la

apoptosis por la va TGFB a
travs de miR15a/Smad7

Resultados
HBV promueve la tumorognesis a travs de la
inhibicin de sealizacin de TGFB por medio de la
les inyect clulas HepG2, HepG2c5 y
regulacin
deSeSmad7
Se comprob la viabilidad celular
de
HepG24d14 y HepG2 luego de tratarse
con TGFB.

HepG24d14 por va subcutnea ratones y se midi

el tamao de los tumores desarrollados en el
tiempo

La viabilidad de las clulas HepG24d14

es mayor que la de las clulas HepG2
luego del tto con TGFB

Las clulas HepG2c5 y HepG24D14

formaron tumores ms grandes

Resultados
HBV promueve la tumorognesis a travs de la
inhibicin de sealizacin de TGFB por medio de la
De los tumores desarrollados se
regulacin de Smad7
determinaron los niveles de
mIR15a y Smad7

Los tumores
generados de
clulas HepG24D14
expresaron niveles
ms bajos de
miR15a y niveles
ms altos de mRNA
y protenas Smad7

Resultados
HBV promueve la tumorognesis a travs de la
inhibicin de sealizacin de TGFB por medio de la
regulacin de Smad7
Para confirmar la funcin de Smad7 en la tumorognesis de las clulas con HBV, se
generaron 2 lneas celulares derivadas de HepG2: shSmad7#1 & shSmad7#2

Se encontr que la viabilidad

de Smad7 en las lneas
celulares generadas estaba
disminuida, as como su
expresin proteica

Los ensayos de formacin de

tumores mostraron que
aquellos generados a partir de
las lneas shSmad7#1 &
shSmad7#2 fueron ms
pequeos
Smad7 es un pilar fundamental
en el desarrollo de
tumorognesis

Discusin
En este estudio se propuso que el mRNA de HBV actuaba como ceRNAs por
miR15a para regular la sealizacin por TGFB
Contribucin al desarrollo de HCC

La desregulacin por ceRNAs podra conllevar a la evolucin de un cncer

Smad7 es un nuevo blanco de miR15a

Las lneas celulares con HBV son menos receptivas a los procesos de
apoptosis por TGFB

Se necesita investigar ms acerca del mecanismo del HBV para producir HCC

Conclusiones

mRNA de HBV acta

como ceRNAs de
miR15a, regulando as
la sealizacin
activada por TGFB

Pueden existir mas

RNAs virales que
puedan actuar como
ceRNAs y que jueguen
un rol importante en
varios aspectos
celulares

El HBV hace que las

clulas sean ms
resistentes a los
procesos de apoptosis
y estimula la
proliferacin celular

La infeccin por virus de Hepatitis B oculto (OBI): presencia

de DNA de HBV en la ausencia del antgeno de superficie de
Hepatitis B detectable.

VIRUS DE LA HEPATITIS B
TAXONOMIA
Familia Hepadnaviridae
Genero Orthohepadnavirus

Virus envuelto
Partcula viral completa (Dane)
Capside icosadrica (Core)
Reservorio: humano.

Se han descrito 8 genotipos: de la A

a la H. Diferente distribucin
geogrfica y variaciones en la
presentacin clnica.

Estructura del genoma viral

ADN

circular
de
doble
cadena parcial:
o Cadena negativa: 3.2 Kb
o Cadena positiva: 1.7-2.8 Kb
Codifica siete protenas a
partir de cuatro marcos de
lectura abierta (ORF): S, P, C
yX
o Antgeno de superficie del
VHB (HBsAg)
o AntiHBs (anticuerpos contra el
HBsAg)
o Anticuerpos contra la protena
Core
del
VHB
tipo
inmunoglubulina M (anti-HBc
IgM) e inmunoglobulina G (anti-

Introduccin
La infeccin por HBV crnica se caracteriza por la presencia del antgeno
de superficie (HBsAg) positivo en suero y por la viremia.
Caso OBI, persisten los niveles bajos de ADN HBV en suero y en tejidos
del hgado, y no se observa presencia del antgeno HBsAg durante la
infeccin crnica o aguda de HBV.
OBI 4 procesos: transmisin, la reactivacin, la contribucin a la
progresin de la fibrosis heptica y la formacin de carcinoma
hepatocelular (HCC)

OBI (Occult Hepatitis B Virus

infection)

Definicin: Presencia de ADN HBV en el hgado sin HBsAg (con o sin ADN HBV en
suero).

El ADN HBV en suero puede ser detectable, sin embargo se observa en niveles
muy bajos (<200 UI/mL))

Si los niveles de ADN HBV en suero son comparables a los que se detecta
habitualmente en casos de infeccin, se presume un Falso OBI
Falso OBI Se considera una infeccin por mutantes de genes de escape S, que
producen un HBsAg modificado que no es reconocido por los ensayos utilizados
generalmente.
En estos casos la mejor manera es realizar una determinacion de ADN HBV en
hgado ya que el ADN HBV se detecta inclusp cuando HBV no esta presente en
suero.

OBI: presencia de ADN del VHB

detectable sin HBsAg, con o sin anti-HBc
o anti HBs-anticuerpo fuera del perodo
de pre-seroconversin.
Presencia de antgeno central de la
hepatitis B aislado (anti-HBc) en
ausencia de HBsAg y anti-HBs de
anticuerpos
La ausencia de anticuerpo (anti-HBc)
no excluye la presencia de un OBI
seronegativos

Otras definiciones

Clasificacin de OBI
OBI SEROPOSITIVO
[anti-HBc and/or anti
hepatitis B surface (antiHBs) positive]

Casos que inician

como una infeccin
aguda y/o infeccin
crnica y que
posteriormente
pierden la expresin
del HBsAg.

OBI SERONEGATIVO
(anti-HBc and anti-HBs
negative),

Casos en los
cuales se cursa
una infeccin sin
deteccin de antiHBs o anti-HBc
debido a una
mutacin o debido
a la prdida
progresiva de antiHBs.

Tabla 1. Definicin de casos de OBI.

>20% de los casos no hay

deteccin de los marcadores
anti-HBc y/o anti-HBs (OBI
seronegativo).

FALSA OBI
Infecciones producidas por virus que presentan
mutaciones en el HBsAg (mutantes de escape
de genesS) las cuales producen un HBsAg
modificado que no es reconocido por los
anticuerpos utilizados en los kits de ELISA.

Figura 3. Representacin esquemtica del ORF S.

Epidemiologa

- Diferencias
geogrficas
- Caractersticas
de los pacientes
- Las diferentes
tcnicas de
diagnstico

La
prevalencia
de OBI se
ha
reportado
entre
un
rango
del

La prevalencia
de OBI es ms
alta en
paciente con
infeccin por
HCV

OBI se observo
con una mayor
incidencia
en
lugares
endemicos como
Asia (41%-90%
previa
exposicin
a
HBV)

OBI es ms
frecuente en
pacientes con
infecciones o
enfermedades
concominante
s como VIH.

Mecanismos
2. La reactivacin a veces se
1. OBI se caracteriza por una
produce en condiciones de
baja tasa de replicacin in vivo;
inmunosupresin, gracias a una
Sin embargo, las cepas del HBV
ruptura del equilibrio entre el
oculto son competentes para la
sistema inmune y el virus.
replicacin in vitro.
Factores Husped
3.Estudios in vitro mostraron
respuestas de clulas T
antivirales durante varios aos
despus de la recuperacin
clnica de la hepatitis B aguda.

4. Tambin la reaccin inmune

por clulas T de memoria,
citoquinas y SII , son asociadas
con OBI

Factores Virales

1. Las mutaciones de la regin X de HBV

reducen la capacidad de la protena X del
anfitrin para transcribir protenas celulares
que son esenciales para la replicacin viral.

Figura 2. Estructura del genoma del

virus de Hepatitis B.

2. La mutacin de escape en la regin S fue

otro factor viral posible asociado con OBI,
que tambin disminuye la reactividad en los
ensayos de deteccin de HBsAg .

Diagnostico
El estndar de diagnstico OBI es la deteccin de ADN del VHB en la
extraccin de ADN a partir del hgado, como cccDNA persiste en los
hepatocitos.

Una mayor tasa de deteccin de ADN del VHB se ha obtenido con

tejido heptico-snap congelado que con tejido heptico en parafina.

Extractos de ADN deben ser amplificadas por PCR anidada altamente

sensible o por PCR en tiempo real que detecte menos de 10 copias de
ADN del HBV utilizando los cebadores especficos.

Significancia clnica
Transmisin
de OBI

Transfusin
de Sangre

Trasplante
de rganos

Hemodilisis

Herencia

parental

Reactivacin

Evento frecuente en
pacientes
inmunocomprometid
os con OBI, al incluir
hepatitis
sintomtica y HBsAg
re-seroconversin
en la reactivacin
de la OBI

Progresin de
la
enfermedad
heptica
crnica

Los genomas de
HBV
pueden
persistir durante un
largo tiempo en el
hgado, induciendo
leve
necroinflamacin

Ocurrencia
carcinoma
hepatocelular
VHB se integra en el
genoma
husped,
produce protenas con
actividades
prooncognicos, como las
protenas
X
y
mutantes preS-S.

Conclusin

OBI: se define como la presencia

de HV DNA sin el HBsAg
detectable, sin embargo no existe
an un mtodo de deteccin
estandarizado para estos casos.
As mismo OBI puede ser
trasmitido, y causar la reactivacin
de HBV, contribuir al desarrollo de
enfermedades hepticas y de HCV

Referencias
Rios, W., et al. (2013). Infeccin oculta por el virus de la
hepatitis B. Aspectos clnicos epidemiolgicos y
moleculares. Acta Medica Colombiana, volumen 38, No.
3.
Toro, A., et al. (2011). Hepatitis B. Medicina y
laboratorio, volumen 17, nmeros 17 18.