Mtodos Cromatogrficos

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromintro.html
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/
http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/LC/

Cromatografia
Definio
Histrico
Michael Tseewt - botnico russo 1906
Dcada de 30
Dcada de 40 - pratos tericos/impulso CG
Dcada de 60 CLAE
Parmetros em cromatografia:
Tempo de reteno (distncia, volume, tempo de reteno corrigido)
Resoluo
Pratos tericos
Altura equivalente a um prato terico (HETP)

Cromatografia: Classificao
1. Forma fsica do suporte
Cromatografia planar: CP e CCD
Cromatografia em coluna CG e CL
-dimetro interno do tubo(preparativa/ analtica)
-estado fsico da F.M.(gas/lquido/supercrtico)
-tipo de coluna (aberta/fechada)
-fase estacionria (lquido/slido)
2.Mecanismo de separao (processos fsico-qumicos ou
mecnico)
3.Polaridade das fases utilizadas

Mecanismos de separao

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm

Polaridade da fase estacionria:

Fase normal - Fase estacionria polar
Fase reversa - Fase estacionria apolar

Cromatografia em papel

Compostos hidrossolveis, cidos orgnicos e ions metlicos

Princpio: partio (solubilidade)

Quantidade de amostra necessria 10 -3 a 10-6 g
Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular
F.M. - Sistema de solventes
F.E. - gua retida na celulose (papel Whatman)
Mtodos de deteco: fsico-qumicos

Anlise qualitativa: Rf (fator de reteno) - problema : reprodutibilidade

Anlise quantitativa: densitmetro, extrao dos solutos

Cromatografia em Camada Delgada

Mtodo rpido (20-40 min.)

Uso de diversos agentes cromognicos
Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g)
Grande gama de compostos pode ser analisada
Mtodo simples e barato
F.M. - sistema de solventes
F.E - Adsorventes (slica, alumna, celite, amido)
Mtodos de deteco: fsico-qumicos
Princpio: Adsoro (polaridade)

Adsoro depende:

Tipos de adsorventes:

natureza qumica do
adsorvente

G- aglutinantes (gesso amido ou

talco)

rea de superfcie/
tamanho da partcula

H- sem aglutinante (p/ CL)

porosidade da partcula

F- contm fluorescncia

-atividade --> stios ativos

R- adsorvente sem aditivo

P-camada preparativa

Critrios para escolha da fase mvel:

analitos devem ser solveis diferentemente
no deve haver reao entre analitos/FM e
FM/FE

CCD - exemplos

Requerimento da amostra::
detectvel no cromatograma
solvel na FM
estvel luz, oxignio, solvente, no ser voltil

Comparao
CP

CCD

Vantagens:
tcnica simples
no requer
instrumentao sofisticada
baixo custo

Vantagens:
maior sensibilidade
mais rpido
> repetibilidade
< difuso
> faixa de aplicao
reveladores reativos
permite aquecimento
Desvantagens
degradao de compostoslbeis
devido grande superfciede
exposio
dificuldades na quantificao

Desvantagens:
uso limitado
alargamento de banda-difusopouca alternativa de reveladores

Cromatografia Gasosa

Rapidez

Alto poder de separao

Separao de vrias classes

de compostos em uma anlise

Sensibilidade (ppm - ppb)

Facilidade de registrar dados

Variedade de detetor
(especificidade)

Amostras volteis

Compostos termicamente
estveis

Tcnicas auxiliares p/
identificao

Cromatografia Gasosa: aplicaes

Anlise de cidos graxos e triglicerdeos
Anlise de micotoxinas
Anlise de compostos volteis responsveis pelo
aroma caracterstico de alimentos
Anlise de aucares
Anlise de amino cidos
Anlise de pesticidas
Anlise de frmacos
etc
etc

Cromatografia Gasosa : tipos

Cromatografia Gs-Slido
FE: slidos (slica, carvo grafitinizado,
polmeros porosos)
Princpio de reteno:(adsoro, volatilidade)
Cromatografia Gs-Lquido ***
Lquido mantido estacionrio em suporte inerte
Princpio de reteno: solubilidade, volatilidade

Cromatografia Gasosa: Instrumentao

Gs de arraste (FM)
H2, N2, He, Ar
Funo: transporte da amostra
Propriedades: inerte, compatvel com o detetor, puro

Cromatografia Gasosa: Instrumentao

Injetor
Colunas empacotadas - cmara
de aquecimento
Colunas capilares:
split
splitless
on- collum
Cuidados:
Introduzir qtddes reprodutveis
de amostra
Vaporizar totalmente a amostra
sem decomp-la
No discriminar compostos

Cromatografia gasosa: Instrumentao

Colunas - tipos
Parmetro

Coluna empacotada

Diam. Int. (mm)

1-4

Compri/o (m)

1-3

Pratos tericos

2400

Espessura F.E.(m)

Vazo gs (ml/min)

20 - 60

Vol. amostra (l)

02 - 20

Coluna capilar
0,15 - 0,75
10 -100
3000
0,5 - 2
1- 5
0,001- 0,5

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Cromatografia gasosa: Instrumentao

Colunas - fase estacionria (FE)
Apolar: hidrocarbonetos no aromticos, silicones (ex.: SE-30) P.E.
Polar: contm grande quantidade de grupos polares (Ex.:
Carbowax)- interaes tipo pontes de hidrognio
Intermediria: grupos polares ou potencialmente polares em
esqueleto apolar (Ex. SE-52)
Escolha da coluna:
Polaridade da fase estacionria,
dimetro e espessura do filme quantidade de amostras, tempo de
anlise, presso (velocidade da FM), temperatura do forno
Comprimento pratos tericos

Cromatografia gasosa: Instrumentao

Colunas - fase estacionria (FE)
Abreviao de algumas fases estacionrias
DEGA - adipato de dietileno glicol
DEGS - succinato de dietileno glicol
SE-30 - metil silicone
OV -11 - 35% fenil- metilsilicone
Carbowax 20 M - polietilnoglicol

Programao de temperatura

Cromatografia gasosa: Instrumentao

Detetor - requisitos

Alta sensibilidade

Baixo nvel de rudo

Faixa linear ampla p/ a resposta

Resposta p/ os compostos de interesse (universais, seletivos,

especficos)

Insensvel a pequenas mudanas de fluxo e temperatura

Destrutivos/ no destrutivos

Cromatografia gasosa: Instrumentao

Detetor -Tipos

Ionizao de chamas FID (alta sensibilidade, resposta quase universal)

FM = hidrognio ou nitrognio, destrutivo

Condutividade trmica (resposta universal, no destri a amostra) - FM

= helio ou hidrognio,no destrutivo

Captura de eltrons (seletivo p/ halognios orgnicos, nitrilas, nitratos e

organometlicos) FM = nitrognio, no destrutivo

Terminico (seletivo p/ compostos contendo N e P)

Formao de ons pela combusto

da amostra na presena de H2 e O2.
Origina corrente eltrica no coletor
gerando um sinal do qual a
combusto do gs de arraste
descontada

O bombardeamento do gs de arraste com as particulas B geram

eltrons lentos que migram para o nodo gerando corrente
constante que ser registrada como linha de base.
Qdo a substncia que entra no detector capaz de capturar
eltrons, h diminuio da corrente gerando um sinal negativo
proporcional concentrao do composto.

Cromatografia gasosa: Anlise qualitativa

Tempo de reteno
Tempo de reteno relativo
Co-cromatografia com padres (spiking)
Grficos p/ sries homlogas
ndices de reteno (Kovats, ECL)
Tcnicas auxiliares (EM, IR, RMN)

Tr= tempo de reteno

Tm = tempo morto- tempo que a FM leva para percorrer
a coluna
Tr = tempo de reteno corrigido = Tr-Tm

Cromatografia gasosa:Anlise quantitativa

Normalizao

Relao concentrao

Padro interno

Padro externo

rea do pico

Fator de resposta

Normalizao:
Todo componente produz um pico (f)
A resposta do detector dependente apenas da
concentrao (f)

Calibrao externa
Soluo contendo padres de todas as substncias a serem analisadas
Padres em concentraes prximas amostra
Condies analticas devem ser as mesmas, inclusive o volume de injeo

Fator de resposta do detector: determina a real resposta para uma

determinada classe de substncias
Fator de resposta= concentrao/rea

Para um padro contendo a

mesma concentrao de trs
substncias diferentes com
reas A1, A2 e A3

Se assumirmos um fator
como 1,00 por ex. f3 =1,00

Ento, para uma amostra com estas trs substncias, a concentrao de cada
uma calculada utilizando estes fatores:

Exemplo .Uma amostra contm X, Y e Z.

O padro contm 200 mg de cada em 100mL de solvente.
A injeo de 5uL resulta em:

Z a referncia
Fx =1190/238 = 5,8
Fy = 1190/660 = 1,8

II. A anlise daa mostraproblema resulta em:

Multiplica-se cada pico por seu fator:

X= 90 x 5,8

Y = 265 x 1,8 e

Z = 460 x 1

rea total = 450 + 477 + 460 = 1387

Depois calcula-se a % de rea

Z deve estar presente em todas as amostras

Esse mtodo corrige a diferena de volume a cada injeo

Padronizao interna
Uma substncia conhecida adicionada em concentrao
definida em todos os padres e nas amostras;
No co-elui com a amostra
estvel e detectado na concentrao em que se encontra

Etapas:
Faz-se uma curva de calibrao baseada na relao entre as
reas e concentraes do PI e da substncia de interesse
Contamina-se a amostra com um volume conhecido da soluo
estoque do padro interno (PI)

Cromatografia Lquida em coluna aberta

Adsoro:
Alumina, Silica, magnso, carbonato de clcio, amido
Natureza da amostra

1.saturados x insaturados

Comportamento cromatogrfico

> reteno insaturados

2.grupos funcionais
COOH > -OH > -NH3 > -SH > -CHO > C=O > CO2R > OCH3 > CH=CH
e
3. Impedimento estrico

Atividade: I, II ...V ( % de gua adicionada

0----15%)

Cromatografia Liquida de Alta Eficincia (HPLC)

Solvente: Alto grau de pureza, filtrado e degaseificado,

caros

Sistemas de injeo:vlvulas de volumes definidos

Colunas de guarda

Colunas: recheios materiais porosos com partculas

de dimetros o mais homogneo possvel e de
dimetro igual ou menor a 10 um (em geral) Silica e
Alumina.

Colunas com fase ligada silica como suporte

A) formao do ster silicato (Si-O-R)

B)formao da ligao siloxano (Si-O-SiR)

C)Ligao Si-C

At 60.000 pratos tericos

Detector:
Alta sensibilidade
Resposta rpida para todos os compostos da amostra
Insensvel mudanas na Fase mvel
Insensvel mudanas de temperatura
Resposta independente para a fase mvel
Resposta linear
No deve destruir a amostra
Fcil operao
Fornecer informaes qualitativas

Detector Uv-Vis
Detector de Fluorescncia
Detector de arranjo de diodos
Detector de ndice de Refrao
Detectores eletroqumicos
Quantificao:
Calibrao Externa
Calibrao Interna