Introduccin a las protenas

Aminocidos

Molculas anfiprticas

Estructura de los a-aminocidos

Estereoisomera de los aminocidos

Aminocidos Proteicos
Modificados
No incorporados por los ribosomas
Se forman despus de la sntesis proteica
(modificaciones post transduccionales)
Proporcionan propiedades funcionales especficas

Otros aminocidos
modificados

Son modificaciones reversibles,

por ejemplo la fosforilacin es
importante en regulacin y
sealizacin.

 Algunos microorganismo evolucionaron para usar 22

aminocidos (selenocistena y la pirrolisina).
La selenocistena puede considerarse el aminocido 21,
aunque solo se ha encontradoen algunas enzimas
codificadas
por
Escherichia
coli
(formato
deshidrogenada).

 Existen aminocidos no estndar (200) y algunos

presentan actividad biolgica importante pero que no
forman parte de las protenas, ejemplo:
D-Acido Glutamico (en polipptidos presentes en pared
celular de microorganismos).
L-homoserina
(Presente
en
muchos
tejidos,
intermediarios metablicos), etc.
Histidina: histamina, controla la constriccin de vasos
sanguineos, secrecin de HCl por el estomago.
Tirosina; precursor de epinefrina, hormona tiroidea,
tiroxina y triyodotropina.
Neurotransmisores
-aminobutrico (GABA), derivado del Glu
serotonina, derivado del Trp

Ionizacin
A pH cido, el grupo
carboxilo esta protonado
y el aminocido esta en la
forma catonica
A pH neutro, el grupo
carboxilo esta
desprotonado pero el
grupo amino esta
protonado. La carga neta
es cero, tales iones son
llamados Zwitterions
A pH alcalino, el grupo
amino es neutral NH2 y
el aminocido esta en la
forma anonica.

Efecto de los sustituyentes sobre el valor de pKa

-carboxilo es mas cido que los cidos carbixlicos.
-amino es levemente menos bsico que en aminas

Aminocidos
sirven como
buffers
Aminocidos con cadena
lateral no cargada como
la glicina, tienen dos
valores de pKa.:
El pKa del grupo carboxilo es 2.34
El pKa del grupo -amino
es 9.6

Puede actuar como buffer

en dos intervalos de pH.

Enlace Peptdico

La nomenclatura de tres letras

Se empueza a
nombrar a partir del
N- terminal
La secuencia se
escribe como
Ala-Glu-Gly-Lys
Muchas veces se
emplea la
nomenclatura de una
sola letra: AEGK

Peptidos: Una Variedad de funciones

Hormones and feromonas:
insulina (relacin con azcar)
oxitocina (relacin con nacimiento)
sex-peptido (ralcin con apareamiento de la mosca de la fruta)

Neuropeptidos
sustancia P (mediador de dolor)

Antibioticos:
polimixina B (para bacterias Gram - )
bacitracina (para bacterias Gram +)

Proteccin, i.e. toxins

amanitina (hongos)
conotoxina (caracol cono)
chlorotoxina (escorpiones)

Proteinas son:
Polipeptidos (-aminocidos unidos covalentemente) + posiblemente
cofactores,
coenzimas,
Grupos prostticos,
Otras modificaciones
Cofactor es un trmino general para camponentes funcionales no
aminocidos
Iones metlicos o moleculas orgnicas

Coenzima es usado para designar cofactores orgnicos

NAD+ in lactate dehydrogenase

Grupos Prosteticos son cofactores covalentemente unidos

Grupo Heme en mioglobina

Classes of Conjugated Proteins

Dogma Central de la Biologa

Molecular

Cdigo Gentico

Secuencias de aminocidos de la
mioglobina de cachalote y humano

Clasificacin de las protenas

Con base en la funcin:

Catalticas: enzimas.
Estructurales: colgeno.
Contrctiles: actina y miosina.
Defensa natural: anticuerpos.
Digestivas: tripsina.
Transporte: hemoglobina.
Sanguneas: fibringeno.
Respiratorias: citocromos.
Represoras:..

 Con base en la composicin:

Protenas conjugadas: grupo prosttico (grupo no
peptdico orgnico o inorgnico); glicoprotenas,
metaloprotenas, hemoprotenas, flavoprotenas,
fosfoprotenas, lipoprotenas.
Protenas no conjugadas: sin grupo prosttico.

Con base en la estructura tridimensional:

Fibrosas.
Globulares.

Estructuras de las protenas

Estructura secundaria

Estructura de la queratina

Estructura del colgeno

Estructura secundaria y terciaria de

la mioglobina

Tipos de estructuras de protenas

globulares

Estabilizacin de la estructura
terciaria
Fuerzas de atraccin in-in: residuos con
grupos inicos de carga opuesta, lisina,
arginina, cido glutmico y cido
asprtico.
Puentes de hidrgeno entre enlaces no
peptdicos: tirosina y cido glutmico.
Puentes de hidrgeno entre enlaces
peptdicos.

 Interacciones hidrofbicas: entre cadenas

laterales no polares de Leu, Val, Ile, Ala,
Phe y otros aminocidos no polares.
Interaccin con el grupo prosttico: por
ejemplo entre un in metlico y diversos
grupos R.
Puentes disulfuro: Presentes entre
cistenas; ambientes oxidantes presentes
fuera de la clula favorecen su formacin.

Estructura terciaria y cuaternaria

Estructura cuaternaria
Agregados de dos o ms cadenas
polipeptdicas unidas entre s slo por
fuerzas de atraccin no covalentes.
Las protenas de este tipo se conocen
como oligmeros.
Isoenzimas: formas hbridas de protenas.
Por ejemplo la enzima lctico
deshidrogenasa existe por lo menos en 5
formas hbridas.

Desnaturalizacin de protenas

Factores que evitan la

desnaturalizacin
Baja temperatura
En la separacin y purificacin se deben
emplear amortiguadores
La agitacin puede cambiar la
conformacin.

Agentes desnaturalizantes
Temperaturas altas.
pHs extremos.
Mercaptoetanol (reduccin de puentes
disulfuro).
Hidrocloruro de guanidina(6 M).
Urea (6-8 M).
Agitacin vigorosa.
Detergentes (SDS).

Algo de Bioinformtica
Estructuras tridimensionales.
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
Propiedades de las protenas.
http://bioinf.ibun.unal.edu.co/eexplorer/html/index.
html

Hidrlisis de protenas

Algunas proteasas

Bromuro de ciangeno

Comportamiento polianfoltico de
un tetrapptido

Purificacin Separacin de
mezclas de protenas

Separacin se basa en las propiedades

fsico qumicas

Solubilidad precipitacin selectiva (Centrifugacin)

Estabilidad trmica
Carga --Electrofresis, enfoque isoelctrico, IEC
Tamao Dilisis, Sedimentacin (Centrifugacin), GFC
Afinidad por un ligando Ensayos interaccin Pull
down (Centrifugacin), AC
Hidrofobicidad (HIC)

Cromatografa es el mtodo de uso comn

usada para separaciones preparativas.

Separacin de protenas

ttp://www.salinesystems.org/content/figures/1746-1448-4-1-2-l.jpg

FRACCIONAMIENTO POR DISMINUCIN DE LA SOLUBILIDAD

(p.e. sulfato de amonio)

(Voet)

(Voet)

Separacin por Carga

Cromatografa de intercambio
inico
Intercambio aninico
Matriz positiva
Proteinas negativas
Desplazadas por aniones

Intercambio catinico opuesto

pH determina la carga neta de las
protenas
Elucin con gradiente de fuerza
inica o de pH.
Electrofresis en gel en
condiciones nativas

Separacin por
tamao
Cromatografa de
exclusin de tamao
(Filtracin en gel)
Volumen de carga <5%
volumen de la columna
Se diluye la muestra

Dilisis o
concentracin
centrifuga

Separacin
por afinidad
Cromatografa de
afinidad
Ligando libre-perlas
-- centrifugacin
Ligando-Perlas
magneticas
Inmuno ensayos
sobre soportes
slidos

Electroforsis para Anlisis de

Protenas

Separacin en escala
analtica es hecha por
electrofresis
Un campo elctrico
dirige las protenas
deacuerdo a su
carga
Una matriz de Gel
reduce la movilidad
de las protenas
deacuerdo a su
tamao y forma.

SDS PAGE: Tamao molecular

SDS sodio doddecil
sulfato- un surfactante
-

Las miclas de SDS se

unen a todas las
portenas y las
denaturalizan unfold
SDS da a todas las
protenas una carga
negativa uniforme.
La forma nativa de la
protena no importa
Velocidad de
desplazamiento depende
unicamente del tamao: las
ms pequeas son ms
rpidas.

rminacin el peso molecular de una protena problema

Ejemplo de anlisis de protenas por SDS-PAGE en cada paso de una purificacin.

En el ltimo paso hay una nica banda, lo que indica que tenemos la protena de
inters completamente purificada

Ejemplo de SDS-PAGE teido con azul de Coomassie

d
ca
r
a
M

or

PM
e
d

d
ca
r
a
M

or

PM
e
d

GELES BIDIMENSIONALES (2D)

Primero isoelectroenfoque y luego
SDS-PAGE

Ejemplo de gel bidimensional

Cuantificacin de Protenas

Mtodo de Biuret
Gornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by
means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949

El mtodo de Biuret se basa en la reaccin de sales de Cu+2

con molculas que contienen ms de dos enlaces peptdicos en
un medio alcalino; el cobre es reducido a Cu+ formando
complejos color prpura que tienen un mximo de absorcin a
540 nm. El mtodo se usa para soluciones que tienen de 0.5 a
10 mg protena/ml.
Es un mtodo poco sensible. Es til cuando se quiere analizar
grandes lotes de protena.
Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como
tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la
protena con un volumen igual de cido tricloroactico al 10%,
resuspendiendo el precipitado que contiene las protenas en
NaOH 1 N.

Mtodo de Lowry
Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951

El color producido por el mtodo de Lowry resulta de la

reaccin de Biuret sobre los enlaces peptdicos, adems de la
reduccin del reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (FolinCiocalteu) por las protenas pretratadas con cobre en medio
alcalino.
El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptofano y cistena
reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo un producto
inestable que es reducido a azul de molibdeno/tungsteno.
El color azul, es determinado a 650 nm.
Este es un mtodo muy sensible, por lo que permite trabajar
con soluciones muy diludas de protenas (0.02 - 0.5 mg
protena/ml).

Mtodo de Bradford
Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248

El mtodo de Bradford de basa en que el Azul

Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul,
al unirse a residuos aromticos y arginina en las
protenas.
El complejo protena-colorante tiene un coeficiente
de extincin elevado, lo que le confiere gran
sensibilidad.
La reaccin entre el colorante y la protena es muy
rpida (aproximadamente 2 min), y el completo
protena-colorante permanece disperso en solucin
por un tiempo relativamente largo.
Rango de deteccin: 0.5-10 mg protena/ml.

Absorcin Ultravioleta de las

Protenas

La mayora de protenas presenta un mximo de absorbancia a 280 nm, debido a la

presencia de aminocidos aromticos (tirosina, triptofano y fenilalanina).
La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir protenas en concentraciones entre 0.1
y 0.5 mg/ml, en la ausencia de sustancias que interfieran con la lectura.
Algunas preparaciones de protenas parcialmente purificadas pueden tener cidos
nucleicos, los cuales tienen un mximo de absorcin a 260 nm.
Una ecuacin para calcular la concentracin de protena en la presencia de cidos
nucleicos en cubetas de 1 cm de paso es:
(protena)mg/ml = 1.55 A280nm - 0.76 A260nm

La ecuacin fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1.75) en la presencia de cido

nucleico de levadura (A280/A260 = 0.49) y por tanto puede no ser precisa para otras
protenas y otros cidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solucin de protena
0.1% (p/v) vara entre 0.5 y 2.5, dependiendo de la proporcin de aminocidos aromticos
que contengan.

Absorcin Ultravioleta de las

Protenas

Todas las protenas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albmina
srica bovina (0.1% p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con
0.66 a 280 nm). La absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptdico.
Consecuentemente los valores de A 0.1% son casi los mismos para todas las protenas.
Concentraciones de protenas en el rango de 10 a 100 ug/ml pueden determinarse de la
diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva standard graficando A
vs. protenas.

(protena)ug/ml = 144 (Acm215 - Acm225)

La diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten de compuestos

no proteicos en solucin. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se
puede usar 0.1 N NaOH para disolver la protena, pero 5 mM NaOH no causa problemas).

MTODO DEL CIDO

BICINCONNICO (BCA)

FUNDAMENTO
SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LAS PROTENAS REDUCEN LOS IONES
CPRICOS A IONES CUPROSOS BAJO CONDICIONES ALCALINAS. LOS IONES
CUPROSOS REACCIONAN CON EL BCA (VERDOSO) PARA FORMAR UN COLOR
MORADO. EL COLOR FORMADO ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO
PROTICO DE LA MUESTRA.

Ventajas
SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA DEL MTODO DE LOWRY (0.5mg a 10mg)
LA MEZCLA EN UN PASO ES MS FCIL QUE EN EL MTODO DE LOWRY
EL REACTIVO ES MS ESTABLE QUE EL REACTIVO DE LOWRY
LAS SALES DE BUFFER Y DETERGENTE NO INICO NO INTERFIEREN CON LA
REACCIN
LAS CONCENTRACIONES DEL MEDIO DE REACTIVOS DESNATURALIZANTES NO
INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl O UREA 3M)

DESVENTAJAS DEL MTODO DEL

CIDO BICINCONNICO (BCA)

EL COLOR NO ES ESTABLE CON EL TIEMPO. SE NECESITA CONTROLAR

CUIDADOSAMENTE EL TIEMPO ENTRE EL ANLISIS Y LA LECTURA EN ABSORBANCIA.

LOS AZCARES REDUCTORES INTERFIEREN CON LA REACCIN.

ALTAS CONCENTRACIONES DE SULFATO DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIN.

LA RESPUESTA EN LA ABSORBANCIA NO ES LINEAL

Quant-iT Quantitation System

Quant-iT Technology
Dyes are specific to the
macromolecule being measured,
becoming fluorescent upon
binding to DNA, RNA or protein.
Thus, unlike UV absorbance,
when you use the DNA assay, you
know you are only quantitating
DNA and not contaminating RNA,
free nucleotides or proteins.
This higher accuracy means more
confidence when going to
downstream experiments.

100

The Way We Quantitate

New.

Quant-iT Assay Kit

1.
2.
3.
4.
5.

Add buffer to tubes

Add sample to tubes
Add dye to buffer
Wait 5 minutes
Read in Qubit

The revolution is on its way.

Be Part of the New Age in Quantification
101