Cromatografa en Lecho Fijo

Purificacin de Protenas

Soportes
Las
columnas
cromatogrficas
se
encuentran
conformadas por un soporte (empaque) que es que
contiene al material adsorbente. Todo ello contenido
dentro de un recipiente de forma cilndrica
Dichos soportes deben
satisfacer las siguientes
caractersticas :

Modificados qumicamente
Poseer alto poder hidratante
Esferas de dimetro 10 100
Altamente porosos

Los materiales de los cuales pueden ser estos soportes son:

Inorgnicos

Polmeros sintticos

Polisacridos

Slica Porosa

Poliacrilamida (Biogel P)

Vidrio de Poro
controlado

Polimetacrilato (Spheron)

Celulosa (Cellulafine,
Sephacel)

Hidroxiapatita

Poliestireno

Dextrano (Sephadex)
Agarosa (Sepharosa,
Superosa, Ultragel A y
BioGel)

Compuestos Polmero orgnico polisacrido

Poli N,N .- bisacrialmida- dentrano (Sephacryl)
Agarosa dextrano (Superdex)
Agarosa poliacrilamida (Ultradex A A)

Los geles pueden ser :

Caractersticas
Esquema

Microporosos Entrecruzamiento Puntual

Baja resistencia
Filtracin por geles

Macroporosos Poros grandes

Intercambio inico Afinidad

Compuestos
Geles microporosos en poros
de geles macroporosos
HPLC

Las caractersticas de cada soporte son entregadas por los

proveedores, siendo los principales:

Amersham pharmacia biotech

http://www.apbiotech.com

Biorad :
http://discover.bio-rad.com
Whatman

Porcentaje del uso de etapas cromatogrficas

Tipos de Operaciones Cromatogrficas utilizadas

en Purificacin de Protenas (4 MPa)

Tipo de
Cromatografa

Propiedad Fisicoqumica o
Bioqumica

Caractersticas

NO ADSORCION
Filtracin por Geles (GF)
o Exclusin por Tamao

Peso Molecular

Resolucin: Moderada
Capacidad: Baja
Velocidad: Baja

ADSORCION
Afinidad (AC)

Afinidad Biolgica

Resolucin: Excelente
Capacidad: Alta
Velocidad: Alta

Intercambio Inico (IEC)

(Aninico Catinico)

Carga a diferentes pH

Resolucin: Alta
Capacidad: Alta
Velocidad: Alta

Cromatofocusing

Punto Isoelctrico

Resolucin: Muy Alta

Capacidad: Muy Alta
Velocidad: Alta

Interaccin Hidrofbica
(HIC)

Hidrofobicidad Superficial

Resolucin: Alta
Capacidad: Alta
Velocidad: Alta

Fase Reversa (RPC)

Interacciones hidrofbicas e
hidroflicas

Resolucin: Excelente
Capacidad: Intermedia
Velocidad : Alta

CROMATOGRAFIA DE NO_ABSORCIN
CROMATOGRAFIA DE PERMEABILIZACION POR TAMAO
FILTRACIN POR GELES (GF)
EXCLUSION POR TAMAO (SEC)

CROMATOGRAFIA DE FILTRACIN POR GELES

Es la nica Cromatografa de No-adsorcin, no hay interaccin

entre la protena y la matriz.
La protena entra y sale.
No se puede manejar el procesos para evitar la elucin.
Caractersticas
Se utiliza en las ltimas etapas de los procesos de purificacin de
protena.
Se utilizan geles porosos que actan como mallas moleculares
que permiten separar las molculas en funcin de su tamao.
Se utilizan geles microporosos de dextrano o poliacrilamida

Proceso

La matriz es un material poroso, con tamao de poro definido, las

partculas ms grandes no ingresan en todos los poros, luego tienen
un camino ms corto que recorrer y eluyen primero, as
sucesivamente las ms pequeas tienen un camino mucho mayor.

Caractersticas de la elucin

Vt representa el volumen total del lecho, Vo el volumen de huecos en el lecho y Vs

el volumen de solvente dentro de las partculas y Vg el volumen de las partculas
de gel.
Se define el coeficiente de particin, Kav:

donde : VE volumen al cual eluye la protena.

Vt = Vo + Vs + Vg

VE Vo
k av
Vt Vo

Existe una relacin lineal entre el logaritmo del tamao de la

protena (mw) y este coeficiente, Kav:
Kav = A - B log mw
1,0
S-1000

Kav

0,8
0,6

S-500

0,4
S-400

0,2
0,0
1e+4

1e+5

1e+6

1e+7

Peso Molecular

Relacin entre los pesos moleculares y los coeficientes K av

para diferentes matrices analticas de Filtracin por Geles

AAplicaciones
CCromatografa de filtracin por geles se puede aplicar en:
Caracterizacin de protenas, por su peso molecular (mw, [Da])
Determinacin si las protenas estn en forma de dmero u otra ms
compleja. Se comparan los valores de peso molecular obtenidos por
filtracin por geles y por electroforesis.
Desalinizacin de muestras

Purificacin de protenas
Generalmente se utiliza en las ltimas etapas, cuando se tiene poco
volumen de muestra a tratar, dado que:
La capacidad de esta tcnica es baja, slo un 5-10% del volumen de
la columna se puede inyectar como muestra.
La velocidad de flujo es baja , dado que la matriz no resiste mucha
presin por sus grandes poros.

CROMATOGRAFIA DE ADSORCION

CROMATOGRAFIA DE ADSORCION

CROMATOGRAFIA DE ADSORCION

CROMATOGRAFIA DE INTERACCION
HIDROFOBICA (HIC) Y FASE REVERSA (RP)
PROPIEDAD: HIDROFOBICIDAD

Cromatografa de Interaccin Hidrofbica

Teora
Se basa en la interaccin entre los grupos hidrofbicos de las
protenas que componen la mezcla y los grupos hidrofbicos del
absorbente (por razones termodinmicas).

Al igual que en la precipitacin, por disminucin de la

solubilidad, la interaccin hidrofbica se favorece en presencia de
altas concentraciones de sal (que desplazan el agua que solvata las
zonas hidrofbicas)

Caractersticas de las protenas

Hay ms de 40 escalas para caracterizar las hidrofobicidad de los aa, pero
en
trminos generales los amino cidos hidrofbicos son:
Fenilalanina (F)
Triptofano (W)
Metionina (M)
Alanina (A)

Caractersticas de las Matrices

Los grupos hidrofbicos

adsorbente son:

del

Fenil > Octil > Butil

Mientras ms larga es la cadena
mayor es la hidrofobicidad.
Sobre matrices de agarosa.
Se trabaja en presencia de altas concentraciones de sal,
cercana a las de precipitacin de protenas (2M), generalmente
Sulfato de Amonio o Cloruro de Sodio.

Proveedor

Tipo

Tamao
partcula
um

Operacin
Las protenas con alta hidrofobicidad permanecern adsorbidas por
mucho ms tiempo que aquellas que son dbilmente hidrofbicas.

Hidrofobicidad
baja
Hidrofobicidad
media

Hidrofobicidad
alta

Formas de Elucin
Disminucin de la concentracin de sal (Gradiente lineal,
escalonado o isocrtico).
Sal:Sulfato de Amonio, Sulfato de Sodio, Cloruro de Sodio

Formas de Elucin
Incremento del pH : Cambio de carga , aumento en la repulsin con
la matriz.
Reduccin de la temperatura, se ve desfavorecido el efecto de
agregacin.
Adicin de agentes:
Detergentes no inicos
Isopropanol
Acetonitrilo

Comparacin con otras tcnicas

Ventajas
Se puede aplicar directamente luego de una precipitacin con
sulfato de amonio
No se requiere de cambio de buffer
La presencia de sal estabiliza a las protenas

Desventajas
Las protenas pueden interactuar entre s.
Pueden producirse cambios conformacionales en las protenas.
Puede entregar menor resolucin que Intercambio Inico, pero
mayor que filtracin por geles.

Cromatografa de Fase Reversa (RPC)

Principio
Es el principio anlogo a HIC. Los adsorbentes son similares,
cadenas alifticas de entre 8 a 18 carbones, sobre matrices de
silica. Inicialmente slo se utiliz en equipos de HPLC.

En esta tcnica la matriz hidrofbica y el solvente inicialmente es

polar (agua), esto resulta opuesto a lo que es Fase Normal, donde
la matriz es hidroflica (polar) y el solvente es orgnico
(hidrofbico).

Usos

Generalmente se utiliza para protenas pequeas (<30.000 Da)

Peptidos obtenidos por digestin de protenas

Condiciones de Operacin
Fase orgnica
La elucin se lleva a cabo por debilitamiento de las fuerzas de
interaccin debido a la adicin de agentes orgnicos como
Metanol, Acetonitrilo.

Comparacin
Desventajas
Se produce una denaturacin, la protena no eluye en su estado
nativo.
La recuperacin depende de la reversibilidad de dicha
denaturacin

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

(IEC)
CROMATOFOCUSING

PROPIEDAD: CARGA

eTeora
Cromatografa de Intercambio inico
Se basa en la interaccin electrosttica entre los grupos cargados
del soluto y los grupos cargados del adsorbente.
En el caso de una protena globular tpica, sta tiene alrededor de un
55% de residuos cargados en la superficie.

Etapas
1. La protena que contiene en mayor porcentaje
cargas negativas, se ve rodeada por iones
positivos. Esta protena interaccionar con
una matriz que posea cargas positivas.
2. Se producen interacciones electroestticas
entre la protena y la matriz, por lo cual se
desplazan los iones positivos y negativos que
se encontraban interaccionando tanto con la
protena como con la matriz.
3. Una vez que la protena es adsorbida en la
matriz se lava la columna con un buffer que
permita eliminar los contaminantes que no

4.

Posteriormente se eluyen la protenas

adsorbida
en
forma
diferencial
mediante cambios(Gradiente o en forma
isocrtica):
- De fuerza inica
- pH de la solucin eluyente

5. Finalmente se reacondiciona la matriz

para iniciar un nuevo ciclo. Dependiendo
del material se pueden realizar hasta
100 ciclos.

Tipos de Cromatografa de Intercambio Inico

Caractersticas de las protenas

A pH cidos, las protenas se encuentran cargadas positivamente,

debido a la protonacin de los residuos amino;

A pH bsicos, las protenas se encuentran cargadas negativamente,

debido a la disociacin de los grupos carboxilo de los aminocidos
que las componen.
Basando en esta caracterstica la cromatografa de intercambio
inico puede ser de dos tipos:

Intercambio Aninico
(pH> pI, protena cargada en forma negativa)

Intercambio Catinico
(pH< pI, protena cargada en forma positiva)

Intercambio Aninico
Resinas Catinicas
-DEAE (dbil)

Amina Cuaternarias-CH2-N+(CH3)
Q (fuertes)
Intercambio Catinico
Resinas Aninicas
Carboximetil
-O-CH2COO(-)
(CM) dbil
Sulfometil
S (fuerte)

-CH2-SO3(-)

Perfiles de elucin con diferentes tipos de matrices

Dbil

Fuerte

Ventajas
Con una misma columna se puede utilizar a diferentes
pH y obtener diversos perfiles de elucin

Desventajas

Las muestras deben estar desalinizadas antes de ser

aplicadas a este tipo de cromatografa.

Curvas de Titulacin (carga Neta Versus pH)

Diagrama de curvas de titulacin y su aplicacin en la
seleccin de estrategias de purificacin

Reglas

Las protenas quedarn retenidas slo si tienen carga

opuesta a la matriz.

Si se tienen protenas retenidas, su tiempo de

retencin ser mayor a mayor carga.

Existen correlaciones que permiten predecir los

tiempos de retencin en funcin de la densidad de
carga de las protenas.

Perfiles de elucin bajo diferentes condiciones de Operacin

I. Catinico

I. Aninico

Formas de elucin
El objetivo es disminuir la interaccin entre las protenas
cargadas y el adsorbente, para ello se pueden utilizar:
Cambio pH en un gradiente decreciente.

Al variar el pH de la fase mvil vara la carga superficial de

la protena, siguiendo su curva de titulacin. Esta variacin
puede llegar a neutralizar la carga de la protena retenida, lo
que produce la desorcin de la protena. Esta metodologa
debe ser llevada a cabo cuidadosamente debido a que se
puede producir desnaturalizacin de las protenas.
Cambios de pH se llevan a cabo mediante cambios graduales,
por medio de la mezcla de 2 buffer a diferente pH.

Formas de elucin
Cambio de fuerza inica con Gradiente creciente.

En este caso se produce una competencia entre las zonas

cargadas de la protena, que se encuentran unidas a la
matriz, y los iones libres que se adicionan en la fase mvil.
Cuando la concentracin de los iones libres es baja, la
protena continua unida a la columna, pero a medida que
aumenta su concentracin se inicia la desorcin de las
protenas, neutralizndose las interacciones entre la carga
de la protena y la matriz.
Las formas de elucin pueden ser:
Isocrtico
Gradiente Lineal
Gradiente escalonado

Etapas en una IEX- Gradiente Lineal

Etapas en una IEX- Gradiente Escalonado

En el ejemplo se ven diferentes modos para la misma matriz.

Generalmente el gradiente se realiza adicionando una sal
como NaCl, donde Na+ o Cl-, son los iones que interactan
con la matriz.

CROMATOFOCUSING

CROMATOFOCUSING
Este tipo de cromatografa es una extensin de las
operaciones de Isoelectroenfoque a cromatografa, es decir:
1.- En una columna cromatogrfica se genera un
gradiente de pH, mediante polybuffers y,
2.- Debido a que la protena presenta diferente carga a
diferentes pH, sta dejar de migrar (dentro de la columna)
en la zona en la cual el pH es igual a su pI.

Condiciones de operacin
Las matrices son de cromatografa de intercambio
aninicas.
Inicialmente la columna se ambienta a pH alto (pH 9), por
lo cual casi todas las protenas quedan retenidas.
Posteriormente, se adiciona un polybuffer (ajustado a un
pH bajo, pH 6.0) que alteran las condiciones de la fase
mvil, se genera un gradiente pH en la matriz y las
protenas
eluirn
en
orden
a
su
pI.
Con esto se obtiene:
Alta resolucin, se pueden separar protenas de 0.1
unidades de pH.
Muestras muy concentradas.

Desventajas

Para aplicar Cromatofocusing a escala industrial, la principal

desventaja resulta ser la presencia de los polybuffers , los
cuales :
- Son muy caros
- No se pueden utilizar en productos de uso humano.

Comparacin entre Intercambio inico con elucin por pH y

Cromatofocusing

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
(AC)

Cromatografa de Afinidad
Se basa en una afinidad especfica que presenta la protena
por
algn compuesto.
Es la tcnica cromatogrfica ms poderosa y especfica.
Permite altos niveles de Concentracin y Purificacin.

Reduction of stages due to affinity adsorption

Fermentation

100%

Fermentation

100%

Cell
separation

85%

Cell
separation

85%

Ultrafiltration
Diafiltration

85%
Affinity
chromatograp
hy

85%

Ultrafiltration
Diafiltration

85%

Chromatograp
hy
Chromatograp
hy
Chromatograp
hy

85%

Ultrafiltration
Diafiltration

85%

HPLC

85%
85%

85% 32%

HPLC

85%

52%

Principales tipos de ligantes utilizados

en
Cromatografa de Afinidad
Ligante

Caractersticas de las Protenas

Tipos de Protenas que se purifican

Quelatos Metlicos
Inmovilizados (IMAC)

La protena presenta afinidad por iones

metlicos. Los principales iones son:
Cu+2
Zn+2

Protenas con Residuos Superficiales de:

Histidina
-Cistena
-Triptofano

Colorantes

Las protenas presentan afinidad a

compuestos de estructura similar a NAD+,
NADP+. Los siguientes colorantes
presentan dicha similitud:
Cibracron BlueTM
Procion RedTM

Protenas del tipo:

-Quitinasas
-Deshidrogenasas
-Fosfatasas

Lecitinas

Las protenas deben presentar tendencia a

interactan con azcares

Protenas del tipo:

Glicoprotenas
-Polisacridos
Protena de Membrana

Inhibidores
Sustratos

Las protenas presentan afinidad especial a

este tipo de compuestos

Protena A
Protena G

Protenas con regiones especficas que

interactan con inmunoglobulinas

-Anticuerpos

Elementos Fundamentales en una Cromatografa de Afinidad

Soporte:
No debe reaccionar con la protena
Debe ser resistente a la degradacin
qumica y microbiana
Debe poseer poros amplios
Ligante
Debe ser lo suficientemente especfico
Debe generar uniones estables
Debe atraparse en la matriz
Spacers
Debe mantener al ligante en la superficie
Posee, generalmente, grupos metileno
Son hidroflicos

Activadores
Compuestos qumicos que se adicionan
Cada ligante tiene asociado un activador y mtodo de
activacin determinado

Modo de Operacin

1. Se tiene solo el soporte.

2. Se adicionan los spacers que se localiza en la superficie
de la matriz.
3. Se adiciona el ligante especfico.
4. Se activan los ligantes mediante activadores, agentes
qumicos
5. Se inyecta la muestra y se adsorben aquellos componentes
que presentan afinidad con el ligante.
6. Se modifican las condiciones para permitir la desorcin del
producto de inters. Slo por medio de estudios empricos
se puede determinar las condiciones de elucin. Ejemplo
Cambios de pH
Cambios de fuerza Inica
Adicin de detergentes, agentes como EDTA, Imidazole
Slo hay que tener cuidado con las posibles
desactivaciones.

1-2

5
6

Perfil Cromatogrfico

Tipos de Interacciones
1.- IMAC (Cromatografa de Afinidad por Metales Inmovilizados)
CH2COO-

CH2CHCH2-N

Cu2+ (Zn+2)-Protena

IDA: Acido Imidoactico

NTA: Acido Triactico

CH2COO-

IDA: Agente Quelante

de los iones metlicos

2-. Dmeros

Si se utiliza Imidazole como

eluyente, las condiciones de
elucin muy corrosivas, se debe
tratar de reciclar para minimizar
contaminacin.

Dimero

Ligante

Tipos de Interacciones
3.- Diferentes Zonas de Afinidad

Mejoras geneticas para facilitar la purificacin por AC

Insercin de protena A

Insercin de protena G

Ejemplo
Adicin de un extremos de Histidina-IMAC

Original

32

33

34

43

43

29

29

18.4

18.4

14.3

14.3

35

36

37

38

Geles de SDS-PAGE, con tincin de Coomassie- La fraccin Original muestra el estado inicial de la
muestra antes de inyectar a la columna IMAC. Se muestran las fracciones colectadas que presentaban
actividad de b-1,3-glucanasa (Fracciones 32-38)

Ejemplo
Se presenta la siguiente mezcla de protenas
Protena

Peso Molecular
(Da)

Punto Isoelctrico

Hidrofobicidad

Tripsina

34.000

8.0

Media

Pepsina

35.500

2.75-3.0

Media

Gelatinas

100.000

4.8-4,85

Baja

Insulina

40.900

5.30-5.35

Media

Con la informacin que cuenta:

Prediga (dibujando) los perfiles de elucin bajo las siguientes
operaciones cromatogrficas
Intercambio Aninico a pH 6.0
Intercambio Catinico a pH 6.0
Interaccin hidroflica
Filtracin por geles

b) Plantee 2 procesos ptimos para purificar insulina de la

mezcla antes sealada
(Indique tipo de columna y el pH de trabajo en el caso de ser
necesario).
Indique en cada paso que contaminante(s) se estara
eliminando. Considere:
i) el siguiente ranking de eficiencias
Afinidad> Intercambio Inico, HIC >Filtracin por gel

ii) Adicionalmente considerando que cuenta con las siguientes

matrices
Q-sefarosa
SP-sefarosa
Fenil-sefarosa
Sephadex G-100
Protena M (Especfica para Insulina)

Respuesta

Intercambio Aninico a pH 6.0

La tripsina tiene un pI de 8.0 por lo cual se encuentra
cargado positivamente a pH 6.0 y no ser retenido en la
matriz. El resto de las protenas si lo sern en diferente
intensidad dependiendo de su pI. Aquella que tiene menor
pI deber quedar retenida por mayor tiempo. Los perfiles
resultantes seran del tipo:
1,2

Tripsina

Peptina

Gelatina
Insulina

0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

200

400

600

800

Respuesta

Intercambio Catinico a pH 6.0

En este caso a pH 6.0 slo la Tripsina tiene carga positiva,
por lo cual slo ella quedar retenida en la matriz
catinica no as las otras protenas que pasarn sin ser
retenidas. Sera un mtodo adecuado para purificar
Tripsina. Los perfiles seran:
Insulina
Gelatina
Peptina

1,2
1
0,8

Tripsina

0,6
0,4
0,2
0
0

200

400

600

800

Respuesta

Interaccin Hidrofbica
Dado que la gelatina presenta una baja hidrofobicidad no
quedar retenida por mucho tiempo, mientras que las
otras lo harn medianamente. Razn por la cual es una
opcin adecuada para purificar gelatinas. Los perfiles
seran:
Gelatina

1,2

Tripsina
Peptina
Insulina

1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

200

400

600

800

Respuesta

Filtracin por Geles

La gelatina es la que tiene mayor peso molecular luego es
la primera en eluir, tripsina y peptina no tienen caso
diferencia en peso molecular motivo por el cual eluyen
juntas. Los perfiles seran:

1,2

Tripsina
Peptina

Insulina

Gelatina

0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

200

400

600

800

Respuesta
Procesos ptimos
Las alternativas son muy variadas. Una puede ser:
1 Etapa: Cromatografa de Intercambio catinico pH 5.0 (SPsefarosa). Slo quedan retenidas Tripsina e Insulina,
peptina y gelatinas pasan de largo.
2 Etapa Cromatografa de Intercambio aninico pH 6.0 (Qsefarosa) Slo queda retenida Insulina.

Cromatografa Lquida de Alto Desempeo

Cromatografa Lquida de Alta Presin
20-40 MPa
(HPLC)

HPLC son la abreviacin de High Perfomance Liquid

Chromatography o High Pressure Liquid Chromatography.
Antecedentes
HPLC surgi debido a las limitaciones que presentaban las
cromatografas tradiciones, principalmente, debido a
Fenmenos Difusivos.
Como solucin a estos problemas se establecieron procesos
ms rpidos que mejoraban la resolucin.
Se deba trabajar con Flujos ms rpidos, esto involucraba
partculas de adsorbente ms pequeas.

Efectos del tamao de particula en la difusin

de las molculas

Ecuacin de van Deemter

Las partculas ms pequeas provocaban altas presiones

Fue necesario disear:
Bombas
Matrices que soportan altas presiones
(20-40 MPa)
Resinas ms rgidas

Tamaos de poros pequeos

Surge el High Pressure Liquid Chromatography

(HPLC clsico).
Inicialmente slo se aplic a Cromatografa de Fase
Reversa, utilizando solventes orgnicos.

Posteriormente se crean nuevas resinas:

Con alta resistencia (alta presin)
Poros suficientes para permitir el paso
y adsorcin de grandes molculas como las protenas
Existen columnas HPLC para:

Intercambio Inico
Interaccin Hidrofbica
Filtracin por Geles

Pero es esencialmente analtica.