PCR

Reaccin en Cadena de la
Polimerasa
ANA PATRICIA FIGUEROA
SUSANA JARQUN
ALONZO MEJA
NATHALIE MORALES
ALBA VARGAS
WENDY MAYORGA

PCR

Tcnica de Biologa Molecular desarrollada en 1986

por Kary Mullis.

Fundamentada en la propiedad natural de los ADN

polimerasas para replicar hebras de ADN.
Obtiene un gran nmero de copias de un
fragmento de ADN particular.

STR

Se utiliza para obtener suficiente ADN

que permita detectar el nmero de
repeticiones en varios loci.

Tipos de PCR
PCR
anidada

PCR
mltiple

PCR con
transcripta
sa inversa

PCR in situ

PCR en
tiempo
real

Componentes
dNTPS

Tampn de
reaccin

ADN
Polimerasa
s

Cebadores

Molde

Termociclador
Aparato usado en Biologa Molecular
que permite realizar los ciclos de
temperaturas
necesarios
para
la
amplificacin de diversas hebras de
ADN.
Modelo ms comn es un bloque de
resistencia elctrica que distribuye una
temperatura homognea a travs de una
placa durante tiempos programables, durante
los cuales ocurre la desnaturalizacin,
hibridacin y extensin de una molcula de
ADN.

Etapas

Desnaturalizacin
Separacin de
las dos cadenas
de ADN

Hibridacin
Unin del
cebador a la
secuencia
complementaria
en el ADN molde

Extensin
Sntesis de la
cadena
complementaria
por medio de la
ADN polimerasa

Cebadores
Oligonucletidos complementarios a
la secuencia que se desea
amplificar.
Se requieren para iniciar la
replicacin
Se utilizan dos
en cada
reaccin.

Mayor longitud
y temperatura
= ms
especfica

Temperatura
de Anillado
4(G+C) +
2(A+T)

Diseo de Cebadores
Contenido de C y G debe ser
aproximadamente 50%.

Evitar
complementariedad
entre los cebadores.

Secuencia debe ser

nica.

Evitar zonas con largas

secuencias de una sola
base.

Formacin de
dmeros

Temperatura de hibridacin
de los cebadores debe ser
similar.

ADN Polimerasa

Enzimas que intervienen en la replicacin del ADN.

Capaces de adicionar dNTPS a partir de la regin 3 de

un cebador y copiar una secuencia molde.

Utilizacin de diferentes polimerasas en la tcnica de

PCR.

Mtodo para copiar trozos de ADN.

Ciclos y temperaturas

Desnaturalizacin (95C)

Extensin (72C)

Anillado (55C-60C)

Principio Caliente

Mtodos que
permiten comenzar
un PCR slo cuando
la temperatura de
annealing padeci.

Contaminacin
Mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar
contaminados con preparados anteriores de DNA, o con
fragmentos de restriccin purificados .
Contaminacin cruzada entre muestras
Productos de amplificaciones anteriores por PCR

Control negativo?
Muestra que incluye los componentes de la reaccin,
excepto el ADN.
Se usa para comprobar que ninguno de los componentes
de la reaccin est contaminado con ADN de otra
procedencia y que no se han producido errores de
manejo que hayan provocado la contaminacin cruzada
entre muestras.

Electroforesi
s
Mtodo de laboratorio en el que se utiliza una
corriente elctrica controlada con la finalidad de
separar biomolculas segn su tamao y carga
elctrica a travs de una matriz gelatinosa.

Fue empleado por primera vez por en

el ao 1937, pero su importancia vino
a incrementarse cuando en los aos
cincuenta
L.Durrum y Arne W.K. Tiselius ,
impulsaron la electroforesis de zona,
nombre que se asigno a la separacin
de materiales en un campo elctrico
en presencia de algn tipo de
soporte; aunque este termino se
limito originalmente al anlisis de
coloides
y
partculas
submicroscopicas
Se ha convertido en estos ltimos
aos en una metodologa aplicada a
sustancias de bajo peso molecular

Generalidades

Mtodo de separacin de molculas segn la

movilidad de stas en un campo elctrico.

Puede ser:
Sobre la superficie hidratada de un soporte slido
A travs de una matriz prosa
En disolucin

Es frecuentemente utilizado para analizar fragmentos

de ADN generados por enzimas de restriccin PCR.

FACTORES
Campo Elctrico
Es generado por la fuente de corriente
se encarga de asimilar las protenas
cargadas negativamente gracias al SDC
desde la parte superior a la inferior del gel,
produciendo su separacin por tamao

Muestra

Se colocan en el lugar indicado

gracias a la separacin que
realizan los pocillos

Deben ser preparadas en

presencia del tampn de carga

Tampn

Mezcla
en
concentraciones
relativamente elevadas de un cido
dbil y su base conjugada.
Tienen la propiedad de mantener
estable el pH de una disolucin frente a
la adicin de cantidades relativamente
pequeas de cidos o bases fuertes.

Componentes
habituales

Tris

EDTA

SDS

Glicerol

-mercaptoetanol

Soporte

En el se fijan los cristales superior

y separador para la preparacin de
la muestra.

Los cristales deben ser situados a

una distancia considerable para
que se pueda aadir la mezcla.

Gel Agarosa
1.
2.

Preparacin del molde

Preparacin del gel de agarosa
a)
Vaso de 100ml
b)
Tampon de electroforesis y agarosa
c)
Calentar
d)
Enfriar
e)
Dejar que se solidifique

Preparacin del gel para electroforesis

1.
2.

Sacar los topes

Colocar el gel en la cmara de
electroforesis
Llenar la cmara
Sacar el peine que ha formado los
pocillos
Proceder la siempre del gel y llevar a
cabo la electroforesis

3.
4.
5.

Proceso de Electroforesis

Colocar
ADN en
los
pocillos

Se aplica
corriente
elctrica

DNA
agrupado

Se aade
Bromuro
de Etidio

Caractersticas
Electrodo
negativo

Electrodo
positivo

Velocidad
de migracin
inversamente
proporcional al peso de la
molcula

Si 2 componentes tienen la misma

masa,
las
separaciones
sern
incompletas = bandas solapadas

Bandas en diferentes calles

pero misma altura tienen
similar peso molecular

Cmo se comparan las

bandas de ADN?
Se investiga si la posicin
de una de las bandas de
cada marcador gentico del
hijo coincide con una de las
bandas
del
mismo
marcador
gentico
del
supuesto padre.

Se asignan las bandas de DNA de

origen materno del genotipo del
hijo.

Bandas deben coincidir con la mitas

de las bandas del DNA del padre

Ventajas del PCR

A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener una

cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.

El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y anlisis.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.

Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense, diagnsticos,

anlisis prenatales, etc.

Desventajas del PCR

Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se

conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40 pb.

Se necesitan primers especficos que sean complementarios

al fragmento que se desea sintetizar.

La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN.

Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo

investigador o de cualquier otro).

Avances en la ciencia
Gracias a esta tcnica se han podido realizar estudios
genticos en cualquier campo de la ciencia.

Se utiliza diariamente para la identificacin de

cadveres.
En el estudio de escenas del crimen para buscar
rastros del culpable.
Tambin se empleaen la biologa, para identificar
cadenas genticas de plantas, animales o, sobre
todo, microorganismos.

Gracias por su atencin