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Microscopa y

Tcnica histolgica

Docente Jonatan Kasjan


Mdico en Medicina Esttica
Jefe de trabajos prcticos de Histologa UBA
Ayudante de Anatoma Patolgica UBA
Jefe de trabajos prcticos de Histologa
Fundacin Barcel

Instrumentos de la Biologa Celular


Mtodos

de laboratorio:

Cultivos, separacin subcelular, etc.

Microscopia:
Microscopios pticos
Microscopios Electrnicos

Unidad de medida

Valos de la unidad

Milmetros
(mm)

10 m

Micrmetro
(m)

10-6 m

Mtodo de estudio

Estructura
visualizada

Ojo

rganos, Tejidos,

Lupa

Clulas grandes

Microscopas pticas

Tejidos, Clulas
Organoides grandes

Microscopa
Electrnica

Componentes
subcelulares

Microscopa de
Polarizacin

Virus
Macromolculas

Microscopa
Electrnica

Estructura Molculas

-3

Nanmetro
(nm)

10-9 m

Amstrong
()

10-10 m

1mm = 1.000 m = 1.000.000 nm = 10.000.000

Microscopio
Es un instrumento que sirve para visualizar diversas estructuras que escapan al lmite de
resolucin del ojo humano a travs del aumento de los objetos observados

SIMPLES

Una sola lente

COMPUESTOS

Sistemas pticos centrados


FOTNICOS

ELECTRNICOS

Lupa

Microscopio ptico
Microscopio de Campo Oscuro
Microscopio de Fluorescencia
Microscopio de Polarizacin
Microscopio de Contraste de Fases
Microscopio de Interferencia
Microscopio de Luz UV

M.E.T.
M.E.B.

MICROSCOPIO PTICO
Parte Mecnica
Pie
Columna
- Tornillo micro y
Tubomacromtrico
- Soporta ocular
y revolver
Platina
Subplatina
- Da
soporte al
aparato de
iluminacin

Parte ptica
Aparato de Iluminacin
- Condensador
- Espejo
- Diafragma Iris
Objetivo
Ocular

Formacin de la imagen

IMAGEN FINAL: VIRTUAL, MAYOR e INVERTIDA

Objetivos
CLASIFICACIN:
Objetivos secos: el aire se
interpone directamente entre el
objeto y el objetivo. Segn el
aumento: - Seco dbil (10X);
- Seco fuerte (40X)

Objetivos de inmersin: entre el


objeto y el objetivo se interpone
un lquido de ndice de refraccin
superior al aire (agua, aceite de
cedro, etc.)

4X

10X

100X

40X

APERTURA NUMRICA: es la cantidad de rayos luminosos


emergentes del preparado que son captados por el objetivo

A.N.=
A.N. N . Sen
ndice de refraccin
del medio
interpuesto.

Seno del
semingulo de
apertura
(valor mximo = 0,1)

Ej.: Aire: 1
Vidrios: 1,52
Agua: 1,33
Aceite: 1,51
Semingulo de Apertura: Es el semingulo formado por los rayos mas perifricos,
que partiendo de la fuente luminosa penetran en el objetivo

PODER DE RESOLUCIN: es la capacidad de un sistema


ptico para mostrar separados dos puntos situados a muy
pequea distancia entre s.

PR =
LR =

0,61 X
AN

Longitud de onda
de la luz empleada
Ej.: Blanca: 5550
UV: 2500
Electrn: 0,056

LMITE DE RESOLUCIN: es la distancia mnima que


separa dos puntos para poder discriminarlos como tales.

Resolucin del ojo en comparacin


con microscopios
Distancia entre los puntos que se resuelven
Ojo humano
mm

0,2

M.O. de campo claro


m

0,2

MEB
nm

2,5

MET
En Teora
nm
En Prctica
Microscopa de fuerza atmica

0,05
1,0 nm
50 pm

Cuanto menor sea el LR de un microscopio,


nos dar mejores datos sobre la estructura
del objeto que queremos observar
El LR puede disminuir:
: Utilizando luz UV
AN : Cambiando el medio interpuesto entre el objeto y el objetivo
Con Aceite de cedro:

A.N.=
A.N. N . Sen

A.N.

LR =

AN

LR

Utilizando Luz UV:

0,61 X

LR =

0,61 X
AN

Ocular

Tiene como funcin aumentar la imagen dada


por el objetivo, acta igual a una lupa.

PARA CALCULAR EL AUMENTO TOTAL, MULTIPLICAMOS EL AUMENTO DEL


OBJETIVO POR EL DEL OCULAR

Ej.:

40 X 10 = 400X

Microscopio electrnico de barrido

M.O.

M.E.

FUENTE DE ENERGA

Luz solar o artificial

Filamentos de Tungsteno

TUBO

Al aire

Al vaco

LENTES

Ocular-ObjetivoCondensador

Bobinas
electromagnticas

CAPTACIN DE LA
IMAGEN

Ojo- cmara fotogrfica

Pantalla Fluoroscpica o
placa fotogrfica

MONTAJE

Vidrio (portaobjetos)

Grilla de cobre

CLULAS

Vivas o muertas

Muertas

IMAGEN

Color o B/N

B/N

AUMENTO TOTAL

100X-450X-1000X-2000X

1.000.000X

MECANISMO DE
FORMACIN DE LA
IMAGEN

Absorcin desigual de la
luz por el preparado

Dispersin de electrones

NIVEL DE ESTUDIO

Estructural

Ultraestructural

M.
E.
T.

Electromicrografa correspondiente a un macrfago. Se puede observar la presencia de


prolongaciones citoplasmticas abundantes (flechas) y un centrolo (C) en la parte central, rodeado
por vesculas del complejo de Golgi (G). En el citoplasma aparecen dispersos numerosos lisosomas
secundarios (L). 15.000 X.

M.
E.
B.
Electromicrografa de barrido de eritrocitos humanos
normales. Obsrvese la forma bicncava de estos
corpsculos. 6.500 X.

Tcnica histolgica
Se

basa en un conjunto de procedimientos


que nos permiten estudiar y ver los tejidos
y las clulas con mayor claridad cuando
estamos frente el microscopio ptico.

Este

conjunto de procedimientos se puede


realizar mediante la manipulacin de
tejidos vivos o de tejidos muertos.

Cultivo celular
Es

una importante herramienta para el


estudio de poblaciones celulares vivas
fuera del organismo.

Se

denomina cultivo in vitro (ya que se


realiza en frascos de vidrio), y se puede
clasificar en tres categoras, una es el
cultivo de clulas, otra es el cultivo de
tejidos y la otra es el cultivo de rganos.

Examen inmediato o in vivo


Se

utilizan colorantes no txicos y los


microscopios que nos permiten ver clulas
vivas (contraste de fase, interferencia y
campo oscuro).

Se

denomina tincin vital cuando el colorante


se le inyecta a un animal vivo, mientras que la
tincin suprarvital se realiza cuando la
tincin se aplica al tejido o clulas que estn
vivas, pero ya fueron extradas del animal.

Preparacin de tejidos muertos


Obtencin

de la muestra (biopsia o necropsia)

Fijacin:

El objetivo de la fijacin es detener los


procesos celulares dinmicos con la mayor
rapidez posible y mantener la estructura con
las mnimas modificaciones posibles.

Qumicos: Formol glutaraldehido


tetrxido de osmio.
Fsicos: Desecacin calor seco fro.

Inclusin:

Corte:

- Deshidratacin (con alcohol).


- Aclaracin (con xilol).
- Inclusin propiamente dicha
(parafina).

De 5 a 15 micrones con micrtomo.

Coloracin:

Se coloca el preparado en portaobjetos.


- Se hidrata con pasos contrarios a inclusin.
- Se colorea con hematoxilina y eosina.

Montaje

final: Se coloca cubreobjetos con


pegamento.

Mtodos Histoqumicos
Mediante

la histoqumica podremos obtener la


localizacin de estructuras a nivel celular
y se basa en utilizar distintas sustancias que
tendrn una afinidad especfica para la
estructura que queramos localizar.

Hematoxilina

y Eosina:

Componentes basfilos: ADN (cromatina o


cromosoma), ARN (nuclolo y REG) y
cartlago (por GAGs).

Componentes acidfilos: el citoplasma


celular (por las protenas) y las mitocondrias
(protenas en la MMI).

Metacromasia: Este
fenmeno sucede
cuando en un tejido se
encuentran muchas
cargas negativas
muy cercanas entre
s, esto hace que
ciertos colorantes
bsicos (azul de
toluidina) se agrupen
formando polmeros
y de esta manera
cambia el espectro de
absorcin de la luz
cambiando la
coloracin azul por
una prpura o roja.

- Cartlago
- Grnulos de mastocitos
- Nucleoprotenas

Reaccin

de P.A.S: La sigla P.A.S.


representa
la
reaccin
del
cido
perydico de Schiff.

Mediante

esta tcnica podremos poner al


descubierto
hidratos
de
carbono
(glucgeno), glucoprotenas, fibras
reticulares, membranas basales y
GAGs.

Primero

se coloca al preparado con cido


perydico, que lo que hace es romper los
grupos oxidrilo y amino para formar
aldehdos.

Una

vez que tenemos los grupos aldehdos,


lo que se hace es colocar el reactivo de
Schiff (leucofucsina), que se une a los
grupos aldehdos formados previamente y
le otorga al tejido un color rojo magenta.

Reaccin

de Feulgen: tcnica es especfica


para el ADN, ya que la reaccin se da con la
desoxirribosa que se encuentra slo en esta
macromolcula.

Radioautografa:

la tcnica se basa en
utilizar una marca radiactiva que podr ser
ubicada en cualquier tejido en el cual se
encuentre, esta marca radiactiva est
representada por un istopo radiactivo (con
diferente nmero de neutrones).

Radioautografa

Coloracin

de grasas: Se usan sustancias


coloreadas y solubles en grasa que se
disuelven en lpidos.

- Los colorantes ms utilizados se denominan


sudanes y hay varios tipos, el sudn rojo
tie a los triacilgliceroles de los adipocitos,
el sudn negro se usa para teir las vainas
de mielina de las fibras nerviosas, otros
Sudanes son el Black y el amarillo, tambin
se utiliza el aceite rojo O (no es un sudn).
- Es importante aclarar que cuando queramos
ver lpidos fijemos las muestras en formol
y luego se realicen cortes por congelacin.

Inmunomarcacin:

Esta tcnica se basa en


la especificidad de la unin de un antgeno
con un anticuerpo, un antgeno es una
sustancia que puede ser reconocida como
extraa y un anticuerpo es una inmunoglobulina (protena) que reconoce al
antgeno (sustancia extraa).

Se puede realizar inmunomarcacin de


tejidos y se denomina inmunohistoqumica, esta se realiza en los cortes de la
tcnica histolgica, mientras que la
inmunomarcacin
de
las
clulas
se
denomina inmunocitoqumica.

Muchas gracias