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C OD ME
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P
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IC

CORYNEBACTERIUM

Gram-positivas, forma de barra, distribuidas

en la naturaleza, productos alimenticios y
tambin en lamucosay piel del hombre y
animales.

catalasapositivas , carecen demovilidad,

bacilos rectos o ligeramente curvados, forma
de V o formas elipsoidales, aerobias o
anaerobias facultativas, quimioorganotrofos.

Pleoformismo

necesitanbiotina, algunas cepas requieren

tiamina y acido p-aminobenzoico. crecen en
caldo simple,medio de loeffler,agarsangre
ytelurio potasico(AST), formando colonias
pequeas grisceas de aspecto granuloso,
traslcidas con centros opacos, convexas con
bordes continuos.

son utilizadas en procesos industriales, como en la produccin de

aa,Una de las especies ms estudiadas es Corynebacterium
glutamicum, el trminoglutamicumse debe a su capacidad de
producir acido glutmico.

MODIFICACIN DE LA PERMEABILIDAD
Kinoshita
aisl
un
microorganismo
productor de glutamato que requiere
biotina,
llamado
Corynebacterium
glutamicum.
la permeabilidad puede ser modificada por
el nivel de biotina en el medio.
nivel de biotina:
Bajo el organismo excreta glutamato
Optimo el organismo produce lactato
la permeabilidad de C. glutamicum puede
ser controlada por la composicin del
medio de cultivo.
aislamiento
de
C.
glutamicum

importancia de la permeabilidad en la
produccin de glutamato.

El aislado de Kinoshita era deficiente en biotina y en

alfa-cetoglutarato
deshidrogenasa
(alfa
cetoglutaratosuccinato, ciclo del cido tricarboxlico).

 C. glutamicum en un medio con alta

concentracin
de
biotina
sintetiza
glutamato (25-36% g/mg de peso seco
de las clulas).
La produccin adicional se impidi por
alguna
forma
de
control
de
realimentacin por el glutamato de su
propia sntesis.
Bajo condiciones limitantes de biotina, el
glutamato se libera de las clulas y se
acumula a un nivel de hasta 50 g/dm-3.
El factor crucial en el control de la
permeabilidad parece ser la sntesis de
membranas deficientes en fosfolpidos.

 biotina en la fermentacin de
glutamato requiere la limitacin
de los niveles de biotina en el
medio.
medios de limitacin de biotina.
La inclusin de la penicilina o
derivados de cidos grasos de
sorbitn de polioxietileno tales
como mono-oleato durante el
crecimiento logartmico en un
medio rico en biotina caus una
alteracin en la envoltura celular
que resulta en la liberacin de
glutamato.
modificacin
gentica
de
la
permeabilidad para superar los
mecanismos de control normales
del organismo productor.

Auxtrofo:
se
dice
que
un
microorganismo es auxtrofo cuando
slo es capaz de proliferar en un medio
de cultivo si a ste se ha aadido
alguna sustancia especfica, que el tipo
silvestre,
llamado
prototrofo,
no
requiere,
porque
es
capaz
de
sintetizarla
Prototrofo: Cepa capaz de crecer en
medio mnimo. Organismo que no
requiere otros elementos nutritivos
distintos a los del tipo silvestre del cual
derivan. Se presenta especialmente en
cepas de bacterias, algas y hongos.

AISLAMIENTO DE MUTANTES QUE NO

PRODUCEN INHIBIDORES O REPRESORES
DE
CAPTACION
Los mutantes que no producen ciertos inhibidores de
retroalimentacin o represores pueden ser tiles para la
produccin de intermediarios de las vas no ramificadas y
productos finales de las vas ramificadas.
Los mutantes que se ilustran no producen algunos de los
inhibidores o represores de las vas consideradas y, por lo
tanto, el control de la va est levantado, pero, debido a los
factores de control estos tambin son esenciales para el
crecimiento, deben ser incorporados en el medio en
concentraciones que permitan el crecimiento, pero que no
provoque las reacciones de control normales.
Todos los ejemplos hipotticos discutidos son mutantes
auxtrofos,
pueden
acumular
concentraciones
relativamente altas de productos intermedios o productos
finales, siempre que la mutacin para la auxotrofa se
produzca en el sitio correcto.

va no ramificada controlada por la inhibicin de

retroalimentacin o la represin de la primera enzima de la
va por el producto final, E. Sin embargo, el organismo es
auxtrofo para debido a la incapacidad para convertir C a
D, de forma que el control de la va se levanta y C ser
acumulado siempre que est incluido en el medio a un
nivel suficiente para mantener el crecimiento, pero
insuficiente para causar la inhibicin o represin.

va ramificada controlada por la

inhibicin concertada de la primera
enzima,
por
los
efectos
combinados de y G. El mutante
ilustrado es auxotrfico para
debido a una incapacidad para
convertir C a D, lo que resulta en la
eliminacin del control concertado
de la primera enzima. Siempre que
est incluido en el medio a un
nivel suficiente para permitir el
crecimiento, pero insuficiente para
causar la inhibicin entonces C se
acumular debido al control del
producto final G en la conversin
de C a F.

doble auxtrofo, requiere la alimentacin de ambos y

G.

doble mutante con la supresin de la produccin de G, lo

que resulta en la acumulacin de F.

acumulacin de un producto final

de una va ramificada que se
controla por la inhibicin de
realimentacin de la primera
enzima en la va por los efectos
concertados de y I. el mutante
ilustrado es auxotrfico de I y G
debido a la incapacidad para
convertir C a F y, por lo tanto,
siempre G e I se suministran en
cantidades que satisfagan los
requisitos de crecimiento sin
causar la inhibicin, el producto
final E, ser acumulado.

el aislamiento de mutantes
auxotrficos puede resultar en
el aislamiento de cepas de alta
produccin

mutacin para la auxotrofa en

el sitio correcto

los productos e intermedios

que paran la reaccin son
esenciales para el crecimiento,
as que deben ser incorporados
en el medio en concentraciones
que permitan el crecimiento,
pero que no provoque las
reacciones de control normales.

RECUPERACIN DE AUXTROFOS
procedimiento para seleccionar auxotrofos relevantes de los
sobrevivientes de una mutacin y posteriormente detectar
los auxotrofos seleccionados para la productividad.
Los mtodos ms comnmente utilizados para la
recuperacin de mutantes auxotrficos son el uso de alguna
forma de cultivo de enriquecimiento o el uso de una tcnica
para identificar visualmente los mutantes.
Los procesos de enriquecimiento se basan en el
establecimiento de condiciones que afectan a las clulas
prototrficas pero no daan a los auxotrofos.
exposicin de la poblacin, en medio mnimo, a un agente
antimicrobiano que slo afecta a las clulas en divisin
debera dar lugar a la muerte de los prototrofos en
crecimiento pero los auxotrofos no crecen as que
sobreviven.

MTODO DE SELECCIN DE LA
PENICILINA
Davie penicilina como el agente inhibidor.
Los sobrevivientes de un tratamiento de mutacin se cultivaron
primero en medio completo, se recogieron por centrifugacin,
se lavaron y se resuspendieron en medio mnimo ms
penicilina. Slo las clulas prototrficas de crecimiento fueron
susceptibles a la penicilina y las auxtrofas de no crecimiento
sobrevivieron.
Las clulas se recogieron por centrifugacin, se lav (para
eliminar la penicilina y productos liberados de las clulas
lisadas) y se resuspendieron en medio completo para permitir
el crecimiento de los auxtrofos, lo que podra ser purificado
despus en medio slido.

 uso del mtodo de seleccin de la penicilina para el aislamiento

de mutantes auxotrficos de C. glutamicum

SEPARACIN MECNICA DE ESPORAS

AUXOTRFICAS Y PROTOTRFICAS

las esporas no germinadas de algunos organismos son ms

resistentes a ciertos compuestos.

mediante el cultivo de esporas mutadas en un medio mnimo slo

los prototrofos germinarn y el tratamiento posterior de la
suspensin de esporas con un compuesto adecuado mataran las
esporas germinadas prototrficas pero dejara ilesas las esporas
germinadas auxotrficas, las cuales pueden entonces aisladas por
lavado, para eliminar el inhibidor, y se cultivaran en medio
suplementado.

mtodo de enriquecimiento de filtracin (organismos filamentosos):

un medio mnimo lquido se inocula con esporas mutadas y se agita
durante unas horas, tiempo durante el cual los prototrofos
germinarn pero el auxotrofos no. La suspensin puede entonces
ser filtrada a travs de un medio adecuado que retiene las esporas
auxotrofas germinadas.

identificacin visual de auxtrofos

exposicin
alternante
de
las
colonias a medios suplementados y
mnimos.
medio suplementadoauxotrfico
rplica en placa: Los organismos
mutantes desarrollan colonias en
placas de Petri en un medio
suplementado y luego se transfiere
una porcin de cada colonia a
medio mnimo.
tcnica que consiste en presionar
un disco cubierto de terciopelo
sobre una placa con colonias
celulares de forma que se adhieran
al material algunas clulas de las
colonias originales y, luego, volver
a presionar con el disco de
terciopelo en placas secundarias
para volver a trasladar las clulas,

"tcnica sandwich

Los sobrevivientes de un tratamiento de mutacin se siembran en

una capa de agar mnimo en una placa de Petri y se cubren con una
capa de agar mnimo estril. La placa se incuba durante 1 2 das y
las colonias desarrolladas estn marcadas sobre la base de la placa,
despus de lo cual una capa de agar suplementado se vierte sobre
la superficie. Las colonias, que aparecen despus de un perodo de
incubacin ms son auxotrficas.