Transformacin de Plantas de Tomate Verde (Physalis

ixocarpa
Brot. var. rendidora) con el Gen oc-I (Oriza cistatina I)
Jorge Cesar Cisneros F.

RESUMEN
Se utiliz un sistema de transformacin por medio de
Agrobacterium tumefaciens para introducir el gen oryza
cistatina I (oc-I) en el genoma de Physalis ixocarpa
variedad Rendidora.
Se inocularon explantes de hoja con la cepa EHA-R 105
de A. tumefaciens portando el vector pCAMBIA::oc-I que
contena el gen reportero glucuronidasa (uidA) y el gen
marcador de seleccin neomicina fosfotransferasa (nptII),
controlados por el promotor 35S.
se seleccionaron cuatro lneas transgnicas (JM-05-II, DJ01-I, DJ-08-II y DJ-12-III), y slo una lnea fue
morfolgicamente normal.

OBJETIVO

En
el
presente
trabajo
se
reporta
la
transformacin gentica de plantas de Physalis
ixocarpa var. Rendidora con el gen oc-I, como una
alternativa biotecnolgica para el control de
plagas.

MATERIALES Y MTODOS

Material
vegetal
Semilla
germino en
in vitro
Tratamiento
- 0.1% (v/v) de Tween
20 -20 min.
- hipoclorito de sodio
al 20% (v/v). - etanol
al 95% durante 10 seg.
Incubaci
n
Medio MS
13-15 das - 28C fotoperiodo -16 h luz y 8
h sombra - intensidad
luz 70 mE (mM/m2/s)

Transformacin de A.
tumefaciens con el
pCAMBIA::oc-I.
-cepa EHA-R 105 se realiz
por el mtodo de cruza
triparental utilizando las
cepas DH5a y RK2003 de E.
coli.
Cultivo de E. coli y A.
tumefaciens
- E. coli se medio LB a 38C
con agitacin 210 rpm
durante 24 h
- A. tumefaciens en medio
YEB
a 28C con agitacin
constante a 180 rpm durante
48 h.

MATERIALES Y MTODOS
Transformacin
gentica del tejido
vegetal.
Medio lquido MS
al 50% haciendo
varias
micropunciones
Los explantes
/ cultivaron
A. tumefaciens
cepa EHA-R 105
durante 30 m
medio lquido MS
incubaron -48 h a
28C en
oscuridad.
Lavado
3- MS al 50%
2- agua estril

medio slido
MS al 100%

conteniendo 0.1 mg/L

de cido indolactico
(AIA), 100 mg/ L de
kanamicina y 500 mg/L
de cefotaxima

MATERIALES Y MTODOS

Ensayo
histoqumico de glucuronidasa
(Gus).
Detectar
la
actividad
de
la
enzima
glucuronidasa para
identificar
los
posibles
brotes
transformados
de
Physalis ixocarpa.
Un trozo de hoja del
brote se coloc en
la solucin Gus, se
incub
a 37C durante 24 h
en oscuridad. Y se

Ensayo
s
Ensayo de la reaccin
en cadena de la
polimerasa (PCR)
detectar la presencia de
los genes introducidos al
genoma
de P. ixocarpa se purific
el DNA de las plantas por
el mtodo de CTAB,
utilizando 300 mg de
tejido vegetal, y se
disearon
oligonucletidos para
amplificar fragmentos de
los genes oc- I, nptII y
uidA

Ensayo de
inhibicin de
papana.
La actividad
enzimtica
de la papana se
analiz de manera
indirecta por la
produccin
de p-nitroanilina, de
tonalidad amarilla,

RESULTADOS

Regeneracin de plantas
transgnicas.
Semana 1: Observ un
alargamiento
de
los
explantes.
Semana 2. Se apreciaron
los primeros indicios de la
formacin de callo.
Semana
3 - 4.
Se
Finalmente, las plantas se
observ la formacin de
transfirieron a macetas con tierra
callos.
estril y se mantuvieron a 28C- 30C
Semana 5. Los explantes
y condiciones de luz controladas .
se
transformaron
completamente en
180 plantas. Se seleccionaron cuatro
Callo.
lneas para los estudios posteriores y
Semana 6. Se empezaron
se nombraron JM-05-II, DJ-01-I, DJa
generar
brotes
08-II y DJ-12-III.
adventicios.
lneas mostraron una respuesta
Despus los brotes se
positiva (coloracin azul) a la
transfirieron a medio MS
reaccin de GUS.
para inducir la formacin

RESULTADOS

Anlisis por PCR

de los genes oc-I,
uidA y nptII.
Se amplificaron por
PCR fragmentos
correspondientes a los
genes de seleccin
(nptII), reportero
(uidA) y de inters (ocI) para analizar su
presencia en el
genoma de tomate.
Se Confirm la
transformacin
gentica de las
diferentes lneas
analizadas.

Ensayo de la
transcripcin
inversa-PCR.
Se analiz la expresin del gen de
inters (oc-I) utilizando el RNA
total de las plantas transformadas.
La intensidad de la bandas fue
diferente para cada una de
ellas; la lnea DJ-12-III mostr
amplificacin
con
mayor
intensidad, lo que sugiere una
mayor expresin del gen.
La banda de amplificacin de la
lnea DJ-08-II fue la de menor.
Las otras dos lneas, DJ-01-I y JM05-II, mostraron una intensidad de
amplificacin intermedia entre las
lneas DJ-12-III y DJ-08-II.

RESULTADOS

Inhibicin de la
actividad enzimtica
de la papana.
Se realiz utilizando
extractos
solubles
obtenidos del tejido
vegetal.
Lnea que mostr la
actividad
inhibitoria
ms alta fue DJ12-III
con
un
48%
de
inhibicin. Seguida por
JM-05-II, DJ-01-I y DJ08-II con un 33.7, 30.1
y 24.4% de inhibicin.

Alteraciones fenotpicas
observadas en las plantas
transgnicas.
La lnea DJ-12-III . Esta planta perdi
la
dominancia apical y desarroll una
gran cantidad de races areas. Las
hojas mostraron un enrollamiento
hacia el interior
del has y fueron alargadas.
Las lneas DJ-01-I y JM- 05-II
desarrollaron un fenotipo similar.
La lnea DJ-08-II, que mostr el ms
bajo porcentaje de inhibicin tuvo un
aspecto fenotpico semejante a las
plantas silvestres y fue la nica lnea
que se pudo aclimatar a tierra hasta
desarrollar flores y frutos.

DISCUSIN

Cuatro lneas denominadas DJ- 01-I, DJ-08-II, DJ-12-III y

JM-05-I fueron seleccionadas para realizar los anlisis
moleculares y bioqumicos posteriores.
La incorporacin del gen oc-I en el genoma de las
plantas se analiz por PCR.
La intensidad de las bandas amplificadas fue diferente
para cada lnea transgnica.
La lnea DJ-12-III mostr la mayor intensidad de banda
y su contraparte fue la lnea DJ-08-II.
Expresin del gen oc-I probablemente se debe a que el
gen se insert en diferentes lugares del genoma, lo
que afect su expresin gentica o a que en las lneas
de mayor expresin se insert ms de una copia del
gen.

DISCUSIN

La lnea DJ-12-III fue la que desarrollo ms alteraciones

fenotpicas, algunas de las cuales fueron prdida de
dominancia apical, alargamiento del tallo y pecolo, el
tallo
principal
present
varias
bifurcaciones
meristemticas, present clorosis y un ensanchamiento
de la lmina foliar, as como el enrollamiento hacia el
interior del as de la hoja.
Las semillas obtenidas de la lnea DJ-08-II podrn ser
utilizadas en un trabajo futuro para analizar el efecto de
la transformacin sobre plagas o patgenos que utilizan
como estrategia de invasin.

BIBLIOGRAFIA

Jos Mara Martnez-Oceguera, Rafael

Gutirrez-Campos, Ernesto GarcaPineda, 2006. Transformacin de Plantas
de Tomate Verde (Physalis ixocarpa Brot.
var. rendidora) con el Gen oc-I
(Orizacistatina I). Revista Mexicana de
Fitopatologa, vol. 24, nm. 1, enerojunio, 2006, pp. 13-19, Sociedad
Mexicana de Fitopatologa, A.C. Mxico.