Tcnicas de Hibridizacin Para

Deteccin de Secuencias
Prof. Dr. Luis Pouchucq M.
Biologa Molecular y Gentica.
Ingenieria en Biotecnologa
UTEM

Hibridizacin
Las tcnicas de hibridizacin utilizan la capacidad del ADN de formar
doble hebra con secuencias complementarias.
Es posible generar sondas (probes) con secuencias especficas que
hibridisen con el ADN o el ARN proveniente de una muestra. Las sondas
pueden ser marcadas radiactiva o fluorescentemente para su posterior
observacin.
Nos permiten observar la presencia de una secuencia de ADN o ARN
especfica.
Las tcnicas de hibridizacin ms usadas son:
Northern Blot
Southern Blot
Hibridizacin in situ
Hibridizacin en Microarreglos.

Southern Blot

Permite detectar la presencia de determinada secuencia de ADN en

una muestra (contra la cual hibridiza la sonda). Es necesario purificar el
ADN de la muestra. La sonda debe estar marcada radiactivamente.
Luego se revela por autorradografa

Northern Blot
Permite detectar la
expresin de un
determinado gen en una
muestra (contra la cual
hibridiza la sonda).
Es necesario purificar el
ARNm de la muestra.
La sonda es de ARN. Debe
estar marcada
radiactivamente.
Luego se revela por
autorradiografa

Hibridizacin in situ
Embriones de Drosophyla

Se fabrican sondas de ARN

con algn tipo de marcaje
(fluorescente, radiactivo o
acoplado a alguna enzima
como la fosfatasa alcalina)
La sondas se hacen hibridar sobre la clula/tejido/organismo completo.
La Muestra debe estar debidamente preparada (fijada y permeabilizada)
La hibridizacin se realiza a altas temperaturas (alrededor de 90C)
Permite observar donde se est expresando un gen

FISH de Cromosomas
Tambin es posible hacer hibridizacin in situ con ADN.
Permite identificar cromosomas o ubicar genes dentro de ellos

Cariotipo Humano

Microarreglos
Un microarreglo es una superficie slida (vidrio, plstico e incluso de silicio)
a la cual se une una coleccin de fragmentos de ADN.
Los chips de ADN se usan para analizar la expresin diferencial de genes,
monitorizndose los niveles de expresin de miles de ellos de forma
simultnea.
Su funcionamiento consiste, bsicamente, en medir el nivel de hibridacin
entre la sonda especfica adherida a la superficie y la molcula diana
proveniente de la muestra,
Cada spot en el
microarreglo contiene
adherida una sonda
especfica

Microarreglos
Chips de ADN
Normalmente la
sonda diana se
marca mediante
fluorescencia.
Los detectores
generan una
imagen del
microarreglo una
vez sometido a
hibridizacion.
Luego se analiza
por anlisis de
imagen,

Microarreglos
Suelen utilizarse para identificar
expresin diferencial de genes
bajo condiciones distintas
transcriptmica.
Para detectar genes que
producen enfermedades
Para la deteccin de
microorganismos patgenos y
ambintales
Para la deteccin de actividades
metablicas en muestras de
medio ambiente

Microarreglos
La impresin de microarreglos se realiza mediante brazos robots

Recomendaciones
- Si va a trabajar con ARN, sea muy cuidado con no contaminar su
muestra recuerde que la piel contiene un sinnmero de RNAsas que
podran arruinar su experimento siempre use guantes.
- Las sondas deben ser construidas cuidadosamente. Deben ser
completamente complementarias con a secuencia que pretende
detectar.. No debe hibridizar con otras regiones del genoma o
transcriptoma verifique contra la base de datos
- Si va a fabricar sondas para ARNm dirjalas en lo posible contra sitios de
empalme de plicing asi se asegura que solo hibridizar el ARN
procesado
- La especificidad de la hibridizacin puede ser aumentada o disminuida
variando la temperatura de hibridizacin y la cantidad de sales disueltas
en el buffer
- Recuerde lavar muy bien luego de la hibridizacion para evitar la
presencia de sonda sin hibridar.