PRACTICAS EN

BIOQUIMICA:
Cuantificacin de Protenas

Mtodo de Biuret
Gornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by
means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949

El mtodo de Biuret se basa en la reaccin de sales de Cu+2

con molculas que contienen ms de dos enlaces peptdicos en
un medio alcalino; el cobre es reducido a Cu+ formando
complejos color prpura que tienen un mximo de absorcin a
540 nm. El mtodo se usa para soluciones que tienen de 0.5 a
10 mg protena/ml.
Es un mtodo poco sensible. Es til cuando se quiere analizar
grandes lotes de protena.
Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como
tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la
protena con un volumen igual de cido tricloroactico al 10%,
resuspendiendo el precipitado que contiene las protenas en
NaOH 1 N.

Mtodo de Lowry
Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951

El color producido por el mtodo de Lowry resulta de la

reaccin de Biuret sobre los enlaces peptdicos, adems de la
reduccin del reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (FolinCiocalteu) por las protenas pretratadas con cobre en medio
alcalino.
El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptofano y cistena
reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo un producto
inestable que es reducido a azul de molibdeno/tungsteno.
El color azul, es determinado a 650 nm.
Este es un mtodo muy sensible, por lo que permite trabajar
con soluciones muy diludas de protenas (0.02 - 0.5 mg
protena/ml).

Mtodo de Bradford
Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248

El mtodo de Bradford de basa en que el Azul

Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul,
al unirse a residuos aromticos y arginina en las
protenas.
El complejo protena-colorante tiene un coeficiente
de extincin elevado, lo que le confiere gran
sensibilidad.
La reaccin entre el colorante y la protena es muy
rpida (aproximadamente 2 min), y el completo
protena-colorante permanece disperso en solucin
por un tiempo relativamente largo.
Rango de deteccin: 0.5-10 mg protena/ml.

Absorcin Ultravioleta de las

Protenas

La mayora de protenas presenta un mximo de absorbancia a 280 nm, debido a la

presencia de aminocidos aromticos (tirosina, triptofano y fenilalanina).
La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir protenas en concentraciones entre 0.1
y 0.5 mg/ml, en la ausencia de sustancias que interfieran con la lectura.
Algunas preparaciones de protenas parcialmente purificadas pueden tener cidos
nucleicos, los cuales tienen un mximo de absorcin a 260 nm.
Una ecuacin para calcular la concentracin de protena en la presencia de cidos
nucleicos en cubetas de 1 cm de paso es:
(protena)mg/ml = 1.55 A280nm - 0.76 A260nm

La ecuacin fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1.75) en la presencia de cido

nucleico de levadura (A280/A260 = 0.49) y por tanto puede no ser precisa para otras
protenas y otros cidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solucin de protena
0.1% (p/v) vara entre 0.5 y 2.5, dependiendo de la proporcin de aminocidos aromticos
que contengan.

Absorcin Ultravioleta de las

Protenas

Todas las protenas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albmina
srica bovina (0.1% p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con
0.66 a 280 nm). La absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptdico.
Consecuentemente los valores de A 0.1% son casi los mismos para todas las protenas.
Concentraciones de protenas en el rango de 10 a 100 ug/ml pueden determinarse de la
diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva standard graficando A
vs. protenas.
(protena)ug/ml = 144 (Acm215 - Acm225)

La diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten de compuestos

no proteicos en solucin. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se
puede usar 0.1 N NaOH para disolver la protena, pero 5 mM NaOH no causa problemas).