Cromatografa

Indice de contenido
Definicin
Elementos que intervienen en un anlisis
cromatografico
Tipos de cromatografa

Cromatografa
Tcnica de separacin muy potente
Los compuestos qumicos se separan en funcin de su
diferente afinidad por una fase mvil y una fase estacionaria
Existen muchas variantes en funcin de la naturaleza de
dichas fases mvil y estacionaria
Tcnicas manuales de laboratorio
Cromatografa de columna
Cromatografa de capa fina TLC

Tcnicas instrumentales
Cromatografa de gases GC
Cromatografa de lquidos LC
Cromatografa de lquidos de alta eficacia: HPLC

Elementos intervinientes en una cromatografa

Fase Estacionaria
Fase Movil
Muestra

Como interaccionan?
En general, una cromatografa se realiza permitiendo que la
mezcla de molculas que se desea separar (muestra)
muestra
interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina
fase estacionaria.
estacionaria Un segundo medio (la fase mvil)
mvil que es
inmicible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta
para "lavar" (elur) a las molculas en la muestra.

La fase estacionaria
Slidos muy porosos con capacidad adsorbente:
Gel de slice (SiO2); Almina (Al2O3)
La superficie del gel de slice interacciona con los
compuestos orgnicos mediante interacciones de
carcter polar, Puentes de hidrgeno,
Interacciones electrostticas.
Los compuestos ms polares interaccionan ms
fuertemente con la slica.

La fase mvil
En cromatografa de lquidos (columna, capa fina,
HPLC) la fase mvil es una mezcla de disolventes:
ELUYENTE
En cromatografa de gases la fase mvil es el GAS
PORTADOR
En el proceso de cromatografa la fase mvil fluye
arrastrando los compuestos que estn retenidos en la
fase estacionaria.
En cromatografa de lquidos la naturaleza del
eluyente tiene una gran importancia

ELUYENTES
Eluyentes polares:
Rompen ms eficazmente las uniones de los
compuestos con la fase estacionaria.
Arrastran ms rpidamente a los compuestos.

Eluyentes no polares:
No rompen las uniones de los compuestos con
la fase estacionaria.
Arrastran muy lentamente a los compuestos.

ELUYENTES
Para conseguir el poder de elucin deseado
se utilizan mezclas de disolventes
Hexano: Acetato de etilo, 100: 1
Hexano: Acetato de etilo, 20: 1
Hexano: Acetato de etilo, 10: 1
Hexano: Acetato de etilo, 1: 1

Mayor
poder de
elucin

ndice de retencin: Rf
El movimiento de los solutos es usualmente
expresado en Rf .
El Rf equivale al cociente de la distancia
migrada por el soluto en relacin al frente
del solvente

Influencia de la estructura de los compuestos

en el Rf
Compuestos muy polares:
Interaccionan fuertemente con la fase
estacionaria:corren poco
Rf pequeo

Compuestos poco polares:

Interaccionan dbilmentemente con la fase
estacionaria: corren mucho
Rf grande

Influencia del eluyente en el Rf

Mezclas con mayor poder de elucin
(ms polares)
Arrastran mucho a los compuestos
Rf mayor

Mezclas con menor poder de elucin

Arrastran poco a los compuestos
Rf menor

Tipos de cromatografas
Cromatografa en Papel
Cromatografa en Capa Delgada (Thing Layer)
Cromatografa en columna
cromatografa de intercambio inico
cromatografa de filtracin en gel
cromatografa de afinidad y de inmunoafinidad

Otras tcnicas de separacin de molculas

Dialisis
ultrafiltracion

Cromatografa en Papel

Descendente

Ascendente

Cromatografa en Papel
Tcnica de mediana resolucin en el cual una mezcla de solutos sembrada
sobre papel de filtro logra separarse entre si basndose en:
Los diferentes coeficientes de particin de los solutos entre la fase
acuosa estacionaria dbilmente unido a las fibras de celulosa del papel y a
la fase lquida orgnica mvil corriendo a travs de la hoja por accin
capilar
Diferencias en la adsorcin del soluto a las fibras de celulosa y
disolucin en la fase mvil.
El movimiento de los solutos es usualmente expresado en Rf . El Rf equivale al
cociente de la distancia migrada por el soluto en relacin al frente del solvente. Para
mayor resolucin se usa la cromatografa BIDIMENSIONAL en donde despus de la
cromatografa clsica se rota 90 la hoja del soporte (en este caso, el papel) y
usando un segundo sistema de solventes se realiza la segunda migracin. De esta
forma, solutos que no haban sido separados totalmente pueden ser completamente
individualizados usando el segundo solvente.

Cromatografa en Papel
El Rf de una sustancia
en el mismo soporte y
con
el
mismo
eluyente siempre
es constante: Rf A
(SiO2, Hex: AcOEt, 5:
1) = 0.47
Una propiedad que
permite
identificar
sustancias en una
mezcla.

Cromatografa en Capa Delgada

Debido a que las distintas molculas en la muestra

presentan diferente coeficiente de reparto, la fase mvil
"lava" a los distintos componentes con diferente eficiencia,
de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase
mvil sern eludos ms rpido que los que sean
preferencialmente solubles en la fase estacionaria

En la cromatografa de capa fina, la fase estacionaria es una

delgada capa de un soporte slido granulado gel de slica,

que se depositan sobre una placa de

almina,
cido silsico
otros

Vidrio
aluminio
otro soporte inerte

Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de

fase estacionaria se aglutina con una pequea cantidad de
sulfato de calcio u otro agente cementante. Las muestras se
aplican aadiendo pequeas gotas de solucin en un pequeo
circulo cerca del extremo inferior de la placa

SECUENCIA DE PASOS

Cargado de la placa

Siembra

Inicio de la corrida

Cromatografa en Columna
Es una tcnica que se emplea en el fraccionamiento de protenas.
Se aplica una muestra compleja de protenas a una columna en la que se ha
situado una matriz slida porosa que est inmersa en un solvente
Se bombea una gran cantidad de solvente a travs de la columna

Las diferentes protenas se van retrasando de manera distinta segn sus

diferentes interacciones con la matriz

Tipos de cromatografa en columna

Cromatografa de filtracin en gel

Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de afinidad y de inmunoafinidad

Filtracion en gel o Gelfiltracin

Utiliza diferentes tipos de miscelas las que al humectarse se transforman
en partculas esferoidales con trama de diferente grado permitindole
seleccionar solutos segn su tamao molecular.

FUNDAMENTOS
Cuando una solucin de solutos atraviesa el gel filtrante, las molculas de
menor tamao al del dimetro de los poros de las esferas penetran dentro de
las mismas debiendo recorrer mayor distancia que aquellas que no lo pueden
hacer (molculas de mayor tamao) retrasndose con respecto a estas y
escurriendo de la columna al final de la elucin.
elucin

De todos los geles, el mas usado es el

que resulta del entrecruzamiento de
Dextrano por la accin de la
Hepicloridina. Cuando este material
(Sephadex)
es
humectado
se
transforma en gel, el volumen total (Vt)
que ocupar este gel en una columna
ser igual a la suma de Vo+Vi+Vg

O sea
Vt= Vo+Vi+Vg

Donde
Vt= Volumen total
Vo= Volumen de lquido que ocupa los espacios extra
esferoidales
Vi= Volumen de imbibicin de las partculas
Vg= Volumen de la matriz del gel
Los solutos grandes al no poder penetrar en los
poros salen en el Vo, mientras que los pequeos
recin emergen en el Vo+Vi.

cromatografa de intercambio inico

USOS
Se utiliza cuando se quiere. separar una mezcla cuyos
componentes son especies qumicas que, a un pH adecuado, se
disocian en iones
Permite separar y purificar determinados analitos que, con
posterioridad, se cuantifican por absorcin molecular, D.O., etc..
En el interior de la columna se sita la fase estacionaria,
estacionaria que es un gel
intercambiador de iones,
iones el cual debe de acondicionarse
previamente al paso de la fase mvil,
mvil que contiene la muestra.
Tras el paso de dicha muestra, se eluyen los componentes no unidos a la fase
estacionaria, y posteriormente se eluyen los componentes unidos (separndose
en fracciones, si fuera el caso) que se cuantificaran por otros mtodos ya
mencionados.

El distinto comportamiento inico que presentan las protenas

expuestas a diferentes pHs permiten cromatogrficamente su
separacin diferencial

La carga neta de las protenas

vara con el pH en que se
encuentran, siendo sta nula en el
denominado punto isoelctrico

imaginemos

Esfera de la matriz intercambiadora

Partcula cargada negativa
Partcula cargada positiva

Elucin con solvente de baja molaridad

(baja fuerza inica)

Aumentar la
molaridad del solvente

Cromatografa de afinidad
Las separaciones se basan en el acoplamiento tpico
de la biologa molecular

La idea de la relacin llave-cerradura

Se trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin slidolquido en la que la sustancia
de naturaleza bioqumica (anticuerpos,
LLave-Cerradura
cofactores, inhibidoresAntgeno-Anticuerpo
enzimticos y otras molculas) denominadas
ligandos de afinidad y enlazados qumicamente en soportes slidos
Enzima-Sustrato
adecuados, retienen a los solutos (analitos), tambin de naturaleza
Enzima-Inhibidor
enzimtico
bioqumica, de manera
reversible y selectiva.

HPLC
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN
VENTAJAS
Disminuye el tiempo de anlisis, aun incluso en mezclas muy complejas
(productos biolgicos).
Permite el anlisis de sustancias termolbiles que no podran ser manejadas por
vaporizacin en un cromatgrafo de gases (se descomponen al vaporizarse).

En esencia, la fase mvil lquida (constituida por un disolvente

adecuado que vehicula a la muestra) se bombea a travs de un
sistema de separacin compuesto por un prefiltro y una columna, que
contiene la fase estacionaria, a una elevada presin.
Por su
distinta interaccin entre las dos fases, la muestra es retenida con
variable intensidad, eluyendo separada de la columna

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

HPLC

Cromatografa en fase lquida en columna a la cual

se aplica una mayor presin que permite acelerar el
proceso de separacin.

Elucin con solvente de baja molaridad

(baja fuerza inica)

Aumentar la
molaridad del solvente

ALTA CONCENTRACIN DE SAL

Volvamos un poco para atrs

Otras tcnicas de separacin de molculas

Dilisis
Ultrafiltracin

Dilisis
Se utilizan membranas semipermeables de Colodion (nitrato de
celulosa) o Celofn con la particularidad de poseer poros de dimetro
estable y conocido lo que les permite actuar como verdaderos filtros
entre molculas de diferente tamao

Ultrafiltracin
Se basa en el mismo fenmeno que la dilisis pudindose utilizar
tambin membranas de colodion o celofn pero adems se utilizan
papeles de filtro, de nitrocelulosa o del tipo Millipore