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Gli indicatori biologici

nello studio delle basse


dosi dei cancerogeni
Antonio Mutti
Torino, 11 dicembre 2006:
CONVEGNO NAZIONALE
Questioni aperte in tema di
cancerogenesi ambientale:
quali le possibili risposte.

Quanto devono
essere basse
le basse dosi
per essere
considerate
basse?

Effetti delle basse dosi

Cosa significa BASSA DOSE?


Mitridatismo

(adattamento), Curve dose/risposta ad U

(ormesi)
Importanza della via di assorbimento per gli elementi
essenziali

Gli effetti di dosi elevate possono non avere


alcuna relazione con ci che si verifica a livelli
parafisiologici
Dosi

diverse possono causare risposte differenti


Curve dose/risposta non monotone possono riflettere
meccanismi multipli

Think Lead

Biological Monitoring Based on Urinary


Chromium in Chromeplating Plants
30

Geometric Mean +GSD


CrU, g/g creatinine

25
20
15
10
5
0

1st

2nd

3rd

4th

5th

6th

Sampling

7th

8th

9th

Effetti
Malattia
Effetti
irreversibili
Effetti critici

LEO

Effetti subcritici
VR

Adattamento (?)
Dose, U.A.

N. Casi osservati

LU.R. per il benzene estrapolata su


sei ordini di grandezza da 7 casi di
leucemia osservati (coorte Plioform)
8
7
6
5
4
3
2
1
0

Unit di
rischio

?
Esposizione cumulativa a benzene, mg/m3 x anni

Stime dellunit di rischio per il benzene


(prima di 7 tabelle, con 8 stime su 21)
Data set

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Rinsky (follow-up from 1950)


Rinsky (follow-up from 1940)
Rinsky (revised exposures)
Rinsky and Ott
Same as 4. (2 questionable cases added)
Wong SMR=50 assumed for unexposed
Rinsky, Ott and Wong
Same as 7. (SMR=100 assumed for unexposed)

95% lower
bound

1.6510-3
1.5310-3
1.7810-3
7.7810-4
4.4510-4
8.7610-5
2.6710-3
1.5610-3

Unit risk estimate (ppm)


MLE
95% upper
bound

5.1010-3 1.0810-3
5.1010-3 1.1310-3
6.4310-3 1.4410-3
2.8910-3 6.8710-2
2.0410-3 5.1010-3
1.0410-2 2.4210-2
7.3210-3 1.6010-2
3.5510-3 6.4310-3

Fonte:EPA(US)

Concentrations of airborne benzene associated with an excess lifetime risk of


1/10.000, 1/100.000 and 1/1.000.000 are, respectively, 17, 1.7 and 0.17 g/m3

Lapproccio ora prevalente


(FDA, EFSA, EPA, etc.) il
Margin of Exposure (MOE)
il rapporto LOAEL/esposizione
umana (LOAEL ricavato da studi
nellanimale);
Si basa sullinterpolazione di dati
sperimentali;
Non richiede estrapolazioni tra
specie n tra dosi;
Non richiede scelta tra modelli;
Evita luso di fattori di

Interpretazione del MOE


Non

una linea netta, intesa come indice


generale di rischio;

Valori

elevati (> 1000) indicano una scarsa


probabilit di effetti nocivi nelluomo;

Valori

vicino a 1 espongono a livelli a cui sono


stati osservati effetti nocivi nellanimale;

Per

valori tra 10 e 100, la gestione del rischio


dipende da vari fattori (natura delleffetto, numero
e suscettibilit della popolazione esposta,
possibilit di alternative, etc.).

Analisi Rischi/Benefici
Analisi

caso per caso:

Possibilit

di esposizione a livelli
associati con effetti tossici nellanimale;
Benefici associati con luso del prodotto
che causa lesposizione
Potenziali alternative e loro rapporto
rischi/benefici
Esempio

del MeHg e dellapporto di


acidi grassi poli-insaturi 3 nel pesce

Rischio Cumulativo

Esposizioni Multiple
Effetti

combinati di miscele di composti


Meccanismi dazione simili o diversi

Esposizioni concomitanti o sequenziali


Lordine

e la durata possono influenzare


eventuali interazioni

Vie Multiple
Effetti

diversi secondo la via di assorbimento


(es. Mn per via gastroenterica o respiratoria)

Effetti combinati

EC(d1+d2)=Ed1 + Ed2 + Ed1 Ed2


Per

Ed1 Ed2 > 0 sinergismo


Per Ed1 Ed2 < 0 antagonismo (competitivo)
Per Ed1o Ed2 = 0 nessuna interazione

Se entrambe le dosi sono subliminali, lo


svolgimento pi frequente della formula :
EC(d1+d2)=0 + 0 + 0

Quali indicatori
biologici usare alle
basse dosi?
Indicatori validi (misure non valide sono
comunque da evitare);
Indicatori facilmente interpretabili;
Indicatori con il miglior rapporto
costi/qualit (proporzionati al quesito).

Indicatori biologici di esposizione a BENZENE


indicatore pi
sensibile
(100 g/m3)

Proposto
(urine), ma
controverso

Interferenza
acido sorbico

Analisi difficile:
instabile e
aspecifico
> 10.000 g/m3
aspecifico

Instabile e
aspecifico, forte
influenza del
polimorfismo
NQO1

Metodi (e costi delle attrezzature)


LC-MS/MS
400.000 euro

Spettrofotometro
colorimetro
GC-MS,
SPME

4.000 euro

80.000 euro
HPLC,
HPLC, rivelatore
rivelatore
elettrochimico
GC, HPLC,
LC-MS/MS

40.000 euro

Environmental and biological monitoring of benzene


exposure in a cohort of Italian taxi drivers
No correlation between benzene exposure and urinary biomarkers.
All benzene biomarkers but EOS t,t-MA were correlated with U-cotinine.
GSTM1 polymorphism modulated S-PMA excretion
1.0

1.5

0.8

0.6

Log EOS U-B (g/l)

Log EOS S-PMA (g/l)

0.4

1.0

1000

2000

EOS U-Cotinine (g/l)

3000

0.5

0.0

r = 0.631

Log EOS U-B = -0.11 + 0.00 x EOS U-Cot

Log EOS S-PMA = 0.51 + 0.00 x EOS U-Cot

-0.5

r = 0.673

0.2

1000

2000

EOS U-Cotinine (g/g creatinine)

(Manini et al., 2006)

M1-R (g/l)

5000

1000
500

100
50

10

10

100

GSTM1
Positive
R2 = 0.37
Null
R2 = 0.33

400

MA + PGA (mg/l)

Il genotipo GSTM1
modifica la regressione
tra i principali metaboliti
dello stirene il principale
PHEMA nelle urine di
lavoratori esposti

- Conclusione 1:
Due differenti BEI per i PHEMA (Haufroid et al.,
2001)

1330 g/g creat


2878 g/g creat

per i soggetti GSTM1null


per i soggetti GSTM1pos

- Conclusione 2:
Linterferenza del genotipo GSTM1 limita luso
dei PHEMA come indicatori di esposizione a
stirene
(De Palma et al., 2001).

Reference values for styrene metabolites in u


8

No. of subjects

No. of subjects

0.084-2.339 mg/g creat.


12

0.009-1.238 mg/g creat.


6

2
3

0.43

0.86

1.29

1.71

2.14

2.57

3.00

Mandelic acid, mg/g creat.

0.20

0.40

0.60

0.80

Phenylglyoxylic acid, mg/g creat.

Potential sources: Smoking habits, air


pollution (ethylbenzene), food packaging (
Antonio Mutti
University of Parma

Manini et al., Int. Arch. Occup. Environ. Health, 2004

N. di casi

Interazioni Geni-Ambiente nei tumori

Geni
Solo
x
Geni Ambiente
5

Solo
Ambiente
95

Contributo relativo dellambiente

Epidemiologia molecolare e le
interazioni Gene-Ambiente a basse
dosi

Altri fattori:

Polimorfismi metabolici
Esposizione Attivazione
Detossificazione
Bassa
ad agenti
Alta
chimici
Alta
Alta

Bassa
Bass
a
Alta

Bassa

Alta
Bassa
Alta
Bassa

Bassa

Antonio Mutti
University of Parma

Alta

Polimorfismo degli
enzimi di
RR riparazione del DNA
Fenotipo (induzione,
inibizione
competitiva legata
ad abitudini
voluttuarie, stili di
vita, co-esposizioni
ecc.)
Sistema
immunitario
Polimorfismo dei
recettori di ormoni,
fattori di crescita,
neurotrasmettitori,
ecc.

Valutazione (provvisoria)
dellepidemiologia
Genomica e proteomica sono
molecolare
promettenti per la diagnosi, ma non
sembrano altrettanto utili per la
prevenzione.

Le interazioni (gene-gene e geneambiente) sono complesse e instabili


(lespressione genica spesso
transitoria).
La corrispondenza tra genotipo e
fenotipo pu essere scarsa, il che pu
Antonio Mutti
condurre
a false conclusioni.
University
of Parma

Stiamo puntando troppo sulla


genomica per afferrare le
interazioni gene-ambiente?

GENI
ambiente

Uca Pugnax
Antonio Mutti
University of Parma

(Granchio violinista)

On the need for an exposome


Unlike the genome, the exposome
evolves throughout the lifetime of
the individual... However, the
challenge may not be more
daunting than the one faced two
decades ago of investigating an
estimated 10 million SNIPs in the
human genome.
Chris Wild, 2005
Antonio Mutti
University of Parma

Example of metallic elements


measured by ICP-MS in exhaled
breath

Antonio Mutti
University of Parma

A. Mutti et al. Chest, 2006

Metals in exhaled breath


condensate as COPD biomarkers
Grant: R01 HL72323
Universit degli Studi di Parma

(Antonio Mutti, P.I.)

Universit degli Studi di Brescia, Italia


(Pietro Apostoli)

University of Massachusetts at Lowell, USA


(Donald Milton)

Universit Catholique de Louvain, Belgio


(Alfred Bernard)

A. Mutti. Grant NIH R01 HL72323


Elements in tobacco smoke

Transition elements
(Cr, Cu, Mn)
Strong
oxidants

Heavy metals
(Cd, Pb, Hg)
High affinity
for SH groups
GSH depletion

Oxidative
stress
Cell injury
Inflammation

Re-oxygenation
injury

Hypoxia
Perfusion/ventilation
imbalance

Tissue injury
and remodelling

Disease
(COPD)

Antonio Mutti, Massimo Corradi, Matteo Goldoni,


Maria Vittoria Vettori, Alfred Bernard and
Pietro Apostoli
Exhaled Metallic Elements and Serum
(CHEST 2006; 129:12881297)
Pneumoproteins in Asymptomatic
Smokers and Patients With COPD or Asthma

Antonio Mutti, Massimo Corradi, Matteo Goldoni,


Maria Vittoria Vettori, Alfred Bernard and
Pietro Apostoli
Exhaled Metallic Elements and Serum
(CHEST 2006; 129:12881297)
Pneumoproteins in Asymptomatic
Smokers and Patients With COPD or Asthma

Antonio Mutti, Massimo Corradi, Matteo Goldoni,


Maria Vittoria Vettori, Alfred Bernard and
Pietro Apostoli
Exhaled Metallic Elements and Serum
(CHEST 2006; 129:12881297)
Pneumoproteins in Asymptomatic
Smokers and Patients With COPD or Asthma
*
*

1.75

1.75

*
*

1.50

1.25

Cd ( g/L) in EBC

Cd in EBC ( g/L)

1.50

0.92
0.52

1.25
1.00
0.20

0.15

0.050

0.10

0.025

0.05

0.000

0.00
Controls

Smokers Asthmatics

COPD

Smokers
Ex smokers
COPD patients

Controls

VOCs in Alveolar Air from Patients with


Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) and
controls.
Relative intensity (S/IS ratio)

GC-MS profiles

NSCLC 2
NSCLC 4

Retention time
Antonio Mutti
University of Parma

Control 1
Control 2
Control 3

Retention time

Conclusioni
Le tecniche moderne consentono di
misurare lesposizione della popolazione
generale.
Il fattore limitante il costo, che - per unit
di rischio - in crescita esponenziale.
Nello studio delle interazioni geneambiente dovrebbero essere dedicate pi
energie alla definizione di esposomi ed al
monitoraggio biologico.
Non solo, ma soprattutto a basse dosi,
cruciale la scelta dei controlli e la verifica
della loro appartenenza alla popolazione
generale.
Antonio Mutti
University of Parma

Importanza (e difficile scelta) dei controlli


nello studio degli effetti di basse dosi:

il ruolo dei valori di riferimento


Gruppo non
esposto

Soggetti suscettibili

V.R.
Popolazione generale
Popolazione generale

V.R.

Vicini con esposizione simile

Trovare i controlli giusti pu


essere pi difficile del previsto

Grazie per la vostra


attenzione!

Antonio Mutti
University of Parma

Rex ha
cercato di
restare in
equilibrio,
ma un
cane
vecchio e
lesercizio
nuovo

Cromo(VI) nel condensato


dellaria esalata
Estratto da:
Recent developments in human
biomonitoring: non-invasive
assessment of target tissue
dose and effects of
pneumotoxic metals
Antonio Mutti

Exhaled biomarkers
Adverse effects by
air pollutants may
be due to their
strong reactivity or
poor solubility.
In either cases,
retained dose
(exposure) seems
to be the main
determinant of
pneumotoxicity.

Exposure
(Target tissue dose)

Lung

Effect
(NO, H2O2, mediators, etc.)

Target site
G.I.
Tract

Liver

Blood
Kidney

Urine

Skin

Systemic Markers of
Internal Exposure/Dose

Exhaled Breath Condensate:


How to collect it?
TURBO-DECCS: Transportable Unit for Research on
Biomarkers Obtained with Disposable Exhaled Condensate
Collection Systems

Transportable (3Kg), temperature control, disposable device

EBC Collection in Practice


non invasive method;
simple (disposable
device), suitable for
field studies;
easy to repeat;
applicable in all
subjects;
simple matrix (water);
analysis possible
without sample
manipulation.

Cr(VI)-exposed workers Chrome plating


Owing to higher temperature, longer
electrolitic process, and higher Cr(VI)
concentrations, hard (thick) chromeplating is
associated with higher exposure levels as
compared to decorative (thin) plating.

From Guidetti, Thesis,


University of Parma,

Cr(VI)-exposed workers Chrome plating


p=0.025
p<0.0001

Cr-U (g/g creat)

100

10

6.63

7.84
4.73

Reference
Interval

0.1
Pre-shift Fri.

Post-shift Fri.

Pre-shift Mon.

Caglieri et al. EHP 2006

Cr(VI)-exposedworkers

Chromeplating

p=0.0044
p=0.0272

100

Cr-EBC ( g/l)

10
3.78

4.98
2.80

0.1
Reference Interval

0.01
Pre-shift Fri.

Post-shift Fri.

Pre-shift Mon.

Caglieriet al.EHP 2006

Reference
Interval

Cr(VI)-exposed workers Chrome plating


p=0.0092

10

H2 O2-EBC ( M)

p=0.007

p<0.0001

0.61
0.37
0.18

0.1
Reference interval

0.01
Pre-shift Fri.

Post-Shift Fri. Pre-shift Mon.

Caglieri et al. EHP 2006

Reference
Interval

EBC from
Cr(VI)-exposed workers

Chrome plating

H 2O 2-E B C ( M )

10

0.1

r=0.56;p<0.0001

0.01
0.01

0.1

10

100

Cr-EBC(g/l)
Caglieri et al. EHP 2006

Cr speciation in
EBC
Cr-EBC ( g / l )

10

2.6

0.9
*

1.5

Chrome plating

0.2

*
1

0.1

Cr tot

Cr(VI)

Post-shift

Cr tot

Cr(VI)

Next morning

Goldoni et al. Anal Chim Acta 2006

Cr speciation in
EBC
67.7%
*

Cr(VI)/Cr TOT

33.5%
**

Chrome plating

16.5%
**

0.1

0.01

* = p<0.05; ** = p<0.01
Airborne

End-of-shift

Next morning

Goldoni et al. Anal Chim Acta 2006

Cr in EBC

Chrome plating

Conclusions

Airborne Cr(VI) was reduced by 50%


in airway lining fluid sampled at the
end of exposure.

A further 50% reduction was


observed after 15 h.

The persistence of Cr(VI) in EBC and


its correlation with inflammation
markers (H2O2) supports the use of
EBC to assess target tissue levels of
Cr(VI).

Acknowledgements

University of Parma, Italy: Massimo Corradi, Matteo


Goldoni, Paola Manini,
Olga Acampa, Rossella
Alinovi, Roberta Andreoli, Andrea Caglieri, Giuseppe De
Palma, Giuseppina Folesani, Paola Mozzoni, Diana Poli

University of Brescia, Italy: Pietro Apostoli


UCL, Brussels, Belgium: Alfred Bernard
University of Massachusetts at Lowell, MA: Donald Milton
NIOSH, Morgantown, WV: Kay Kreiss, Nancy Sahakian
ITALCHILL, Parma, Italy: Carlo Valesi