AISLAMIENTO Y SELECCIÓN

DE BACTERIAS FOSFATO
SOLUBILIZADORAS A PARTIR DE
SUELO PARA USO AGRICOLA
DE LA PROVINCIA DEL NAPO
INTRODUCCION
 En los suelos tropicales
los bajos niveles de
fosforo no están
disponibles para el
crecimiento de las
plantas lo que
condicionan la
productividad de los
cultivos;
especialmente en las
regiones a
temperaturas altas
como El Chaco, por
lo que es muy poco
soluble..

El problema radica en los sustratos que son
fuente de fósforo y que deben pasar a hacer
fuente disponible, pasando de fósforo orgánico
a inorgánico, por que las plantas solo pueden
tomarlos como ión ortofosfato, esto se logra
mediante hidrólisis por enzimas fosfatasas,
pues el fósforo soluble es un nutriente limitado
en un ecosistema natural..
Localización de la zona de estudio
 Lamuestra del suelo
se tomo en la
provincia del Napo
en la zona del
Chaco, el sector de
estudio abarca 1
hectárea y va a ser
destinada para uso
agrícola.
 Provincia del Napo
MARCO
TEORICO
IMPORTANCIA DEL FOSFORO

Luego del Nitrógeno, el Fósforo es un fertilizante

esencial para el desarrollo y el crecimiento de las
plantas como para microorganismos. El fósforo
soluble es un nutriente limitado para producción de
biomasa en un ecosistema natural.
Dependiendo del tipo de suelo, se puede decir que
entre un 50-60% corresponde a la fracción
orgánica, mientras que el resto se encuentra en
forma inorgánica.
Las plantas absorben el fósforo en forma
inorgánica en estado soluble, pero cuando se
introduce al suelo, más del 90% de esta pasa
rápidamente a formas solubles no disponibles.

De esta manera, gran parte de los fertilizantes

fosfatados que se aplican no son utilizados por
las plantas, sino que se almacenan en el suelo.
Las plantas deben absorber el elemento del
suelo, donde se encuentra en muy baja
concentración.
Estos índices bajos del nutriente se deben a que
el fósforo soluble reacciona con iones como el
calcio, el hierro o aluminio que provocan su
precipitación o fijación, disminuyendo su
disponibilidad para los vegetales.
IMPORTANCIA DEL pH

La disponibilidad del Fósforo depende del pH del

suelo, porque solo puede ser tomado como ion
ortofosfato, para esto el pH óptimo es alrededor de
6.5 pues la precipitación de los fosfatos de
aluminio y calcio disminuye.

El pH del medio es importante para el crecimiento

de los microorganismos, la mayoría de ellos se
desarrollan mejor en medios con un pH neutro
OBJETIVOS
Objetivo General

ØAislar y seleccionar microorganismos

solubilizadores de fosfatos a partir de un
suelo para uso agrícola de la provincia del
Napo.
Objetivos Específicos

ØAislar en medios de cultivo: SMRS y un medio

diseñado, microorganismos solubilizadores de
fosfatos a partir de suelo para uso agrícola de la
provincia del Napo.
ØDiseñar un medio de cultivo con una solución de
fosfato.
ØEvaluar la actividad fosfatasa mediante la
técnica p- nitrofenilfosfato
MARCO
METODOLOGICO
Toma de la muestra
Se toma 5 muestras, cada una de 500 g,
mediante muestreo aleatorio simple; se
depositan en bolsas plásticas selladas. Se
almacenan a temperatura ambiente para su
transporte y luego se conservan bajo
condiciones de refrigeración a 4˚C hasta su
procesamiento en el laboratorio.
Procesamiento de la muestra
Determinación de pH
Se realiza la medición de pH de las muestras de

suelo por el método de pasta de saturación según

el ICONTEC.

Pre enriquecimiento y Aislamiento
10g suelo
150 rpm 90 ml agua de peptona
35 °C 0.5g goma arábiga
72 horas 0.5g CaHPO4.2H2O

0.5 mL 0.05mL 0.05mL 0.05mL

10-4 10-6 10-8

10-1 10-2
Agua de peptona
4.5mL 4.95mL 4.95mL 4.95mL 4.95mL

30˚C ; 2 a 7 días
Siembra por extensión
Por duplicado

SELECCIÓN DE CEPAS POR HALO DE SOLUBILIZACION

Caracterización Macro y
Microscópica de la colonias
La identificación macroscópica de las colonias se
realiza teniendo en cuenta características como
tamaño, color y textura, se identifica la morfología
microscópica realizando tinción Gram y tinción
azul algodón de lactofenol.
Mejoramiento y Diseño del Medio
Se modifico la formulación del medio SMRS
reemplazando el fosfato tricálcico por una
solución de fosfato, utilizando goma arábiga y
CaHPO4.2H2O
Medios de Cultivo
 TABLA I. Medio De SMRS  TABLA II. Medio Diseñado
 
REACTIVO REACTIVO


CANTIDAD CANTIDAD
(g/l)  (g/l)
Glucosa 10.0 Glucosa 10.0
Fosfato tricálcico 5.0 Solución de fosfato
Cloruro de sodio 0.2 Cloruro de sodio 0.2
Sulfato de amonio 0.5 Sulfato de amonio 0.5
Sulfato de magnesio 0.3
Sulfato de magnesio 0.3
Extracto de levadura 0.5
Extracto de levadura 0.5
Cloruro de potasio 0.2 Cloruro de potasio 0.2
Sulfato de Hierro 0.004 Sulfato de Hierro 0.002

Sulfato de manganeso 0.004
Cloranfenicol 0.1

Determinación de actividad enzimática.
Método p-nitrofenil fosfato
Se basa en el uso del sustrato p-nitro fenil fosfato
el que es hidrolizado por fosfatasas para obtener
HPO4.
La actividad de la fosfatasa basta con ajustar el

pH del medio, el sustrato es incoloro y por acción

de la fosfatasa se transforma en p-nitrofenol a
partir del cual se genera p-nitrofenolato que
produce color amarillo.

Medir a 450 nm con un espectrofotómetro, es un
indicador del nivel en el que el sustrato es
hidrolizado por la fosfatasa. (Técnica)
RESULTADOS

 BACTERIAS
Características macro y microscópica de las cepas aisladas
CEPA CARACTERISTICAS CARACTERISTICAS
MICROSCOPICAS MACROSCOPICAS

Cepa 1 Cocos Gram positivos Colonias lisas, bordes irregulares, blancas

(BSP1)

Cepa 2 Cocos Gram positivos Colonias lisas, estrellada, blancas

(BSP2

Cepa 3 Cocos Gram negativos Colonias lisas, redondas, amarillas

De las cuales únicamente se conservaron 2 cepas
pues mostraron mayor actividad enzimática.
HONGOS

Características macro y microscópica de las cepas

aisladas.
CEPA CARACTERISTICAS CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS
 MICROSCOPICAS

Cepa 1 Mucor Tienen hifas tabiculares y Blancos, bordes definidos,

conidioforas cuya cabeza está
localizada en el extremo de un hifa,
compuesta por una vesícula
rodeada por una corona de fiálides
en forma de botella directamente
insertadas sobre la vesícula.[8] De
las fiálides se desprenden las
esporas

Cepa 2 Chysosporium: conidiosporas Lilas,

muchas con hifas hialinas
vegetativas y ramificadas
irregularmente
Cepa 3 Acremonium: conidias Blancos,
elipsoidales que se acumulan
en los extremos de fiálides
largas y finas; clamidosporas
ovales. Surgen ramas
laterales de la hifa.
Cepa 4 Aspergillus conidias oscuras Verdes,
formando un racimo de
esporas; los conidióforos
aparecen de color pardo
amarillento claro y septos
tabiques gruesos.
Cepa 5 Cladosporium: hongo Café verdosa
filamentoso con conidióforos
con cadenas ramificadas de
conidios elipsoides de
extremos redondeados.
HORA ABS Concentración UP (µmol/min L) ABS Concentración UP (µmol/min L) ABS Concentración UP (µmol/min L)

aspergillus umol/ml aspergillus mucor umol/ml mucor mucor umol/ml Mucor

0 0.041 0.053 0.879 0.030 0.040 0.674 0.010 0.018 0.302

0.5 0.077 0.093 1.550 0.050 0.063 1.047 0.050 0.063 1.047

1 0.098 0.116 1.941 0.087 0.104 1.736 0.068 0.083 1.379

1.5 0.111 0.131 2.183 0.099 0.118 1.960 0.098 0.116 1.932

2 0.120 0.141 2.351 0.100 0.119 1.978 0.113 0.133 2.221

4 0.147 0.171 2.854 0.103 0.122 2.034 0.128 0.150 2.500

6 0.160 0.186 3.096 0.140 0.163 2.724 0.150 0.175 2.910

8 0.245 0.281 4.680 0.225 0.258 4.307 0.240 0.275 4.587

10 0.357 0.406 6.766 0.100 0.119 1.978 0.290 0.331 5.518

Preservación
HONGOS

Se conservaron aquellas cepas que presentaron

mayor actividad enzimática

Aspergillus

Mucor

Cladosporium

En crioviales en agua esteril a temperatura de

refrigeración
 

BACTERIAS

Se conservaron:

 

En crioviales en BHI con el 20% de glicerol

 


 CONSLUSIONES
A partir del suelo de la región del Chaco
provincia del Napo fue posible aislar 3
cepas de hongos y 2 cepas bacterianas.
El medio diseñado puede ser alternativa

para el aislamiento y desarrollo de bacterias

fosfato solubilizadoras.
Se determino la actividad de los Hongos, el

Aspergillus tiene 6.766 UP (µmol/min L), en

tanto los otros dos géneros Mucor y
Cladosporium presentaron una actividad
menor. 1.978 UP (µmol/min L) y 5.518 UP
(µmol/min L).

En tanto en las bacterias la mayor actividad
enzimática se consiguió con la bacteria SP1 con un
valor de 4.475 UP (µmol/min L), en tanto la bacteria
SP2 tiene un valor de 1.978 UP (µmol/min L); siendo
la más eficiente la bacteria SP1
Al comparar los resultados de actividad enzimática

se determino que los hongos aislados tienen mejor

actividad frente a las bacterias, pues los valores
obtenidos son más altos.
RECOMENDACIOES

Realizar identificación bioquímica de hongos y

bacterias aislada

FIGURA I. Cepas Aisladas de Hongos Solubilizadores de Fosfato.
En un análisis previo de fósforo en el suelo se
obtuvo 159.23 mg/kg de fósforo total; 4.08
mg/kg de fósforo soluble, por lo tanto 155.15
mg/kg corresponde al fósforo insoluble lo que
representa a una alta cantidad de fósforo que no
puede ser aprovechado por las plantas para
crecer..
En la pasta del suelo Saturado
1.Pesar aprox. 500 g de suelo.
2.
3.Colocar en un recipiente apropiado y añada agua
destilada en pequeñas cantidades, mezclar bien después
de cada adición hasta lograr su saturación (sin quedar
agua libre en la superficie del suelo).
4.
5.Proceda a tomar la lectura del pH en el potenciómetro,
introduciendo con cuidado el electrodo.
Método p-nitrofenil fosfato
Curva patrón de p – nitro fenol

Preparar una solución de p – nitro fenil de 1 umol/ml en

buffer fosfato pH 7.0 a partir de esta y utilizando la
ecuación C1V1 = C2V2
Medir a 450 nm en un espectrofotómetro, colocando 3 ml
del blanco y 3 ml de cada concentración, realizar lecturas
por triplicado.
Realizar regresión lineal donde r > 0.9.
Concentraciones para la curva de calibración 0.05, 0.1,
0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 µmol/ml