Importancia de la Biologa

Molecular en el paciente con

TBC y Cncer
MC. Msc. Vicente Taboada, William.
Laboratorio de Microbiologa
INEN

CONTENIDO
I.
II.
III.
IV.

INTRODUCCION
TUBERCULOSIS Y CANCER
BASES MOLECULARES
MTODOS PARA EL
DIGNOSTICO MOLECULAR.

Maestra de Biologa MolecularUNMSM

TUBERCULOSIS, TBC-MDR,
TB-XDR
PROBLEMA DE SALUD
PBLICA
OMS: 1.500 millones de
personas de infectados.
10 mill casos nuevos /
ao.
Mueren mas de 3 mill /
ao
Enfermedad asociada a
SIDA.
Mayora de casos en
pases en vas de
desarrollo.
Maestra de Biologa Molecular TBC MDR, promedio
UNMSM

Agente etiolgico:
Mycobacterium
tuberculosis
Bacterias de forma bacilar
acidoresistentes, bacilo de Koch
No toxinas, aerobio, no mvil, no
espora, multiplicacin lenta
Causa la mayora de los casos de
tuberculosis.
Micobacterias que causan la TB:
M. tuberculosis
M. bovis
M. africanum
M. microti
M. canetti
M. avium, M. intracellulare en
SIDA - TB Atipica
Maestra de Biologa MolecularUNMSM

lipoarabinomanano

Pared celular micobacteriana.

Tincin ZN
4

TUBERCULOSIS, TBC-MDR,
TB-XDR

Maestra de Biologa MolecularUNMSM

 Factores intrnsecos y
extrnsecos que
contribuyen a la
emergencia de
Tuberculosis
Multidrogoresistente
(TBC-MDR).
Los signos de
interrogacin indican
factores que podrin
estar involucrados, para
los cuales no hay
evidencia directa en M.
tuberculosis.
The heterogeneous evolution of multidrug-resistant Mycobacterium Tuberculosis. Muller B. Et al. Trends in Genetics March 2013, Vol. 29, No. 3

Maestra de Biologa MolecularUNMSM

CONTENIDO
I.
II.
III.
IV.

INTRODUCCION
TUBERCULOSIS Y CANCER
BASES MOLECULARES
MTODOS PARA EL
DIGNOSTICO MOLECULAR.

Maestra de Biologa MolecularUNMSM

TUBERCULOSIS y CANCER
Los pacientes con Cancer son
vulnerables a desarrollar TB activa, debido
a la inmunosupresin por malnutricin, o
por el uso de quimioterapia intensa.
En USA, TBC es 50-100 v mas alta en
pacientes nacidos en el extranjero con
neoplasias hematolgicas.
1970: tratamiento corticoide prolongado,
gastrectomia, leucemia, Enf. De Hodgkin,
silicosis, pneumoconiosis, diabetes no
controlada, embarazo
Maestra de Biologa MolecularUNMSM

TUBERCULOSIS y CANCER

Tasa de Tuberculosis en pacientes con diagnstico de Cncer

Maestra de Biologa MolecularUNMSM

CONTENIDO
I.
II.
III.
IV.

INTRODUCCION
TUBERCULOSIS Y CANCER
BASES MOLECULARES
MTODOS PARA EL
DIGNOSTICO MOLECULAR.

Maestra de Biologa MolecularUNMSM

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LOCALIZACIONES GENOMICAS DE 85
GENES ASOCIADOS A RESISTENCIA A
DROGAS
LAS FRECUENCIAS DE LAS MUTACIONES PRESENTAN UNA VARIACION
DEPENDIENDO DE LA PROCEDENCIA. LA MUTACION 315 PARA katG, EXPLICA LA
RESISTENCIA A IINH EN 52% DE CEPAS DE MEXICO, 62% DE CEPAS DE ESPAA Y
100% DE CEPAS DE KAZAJISTAN.

MUTACIONES POR DELECION O INSERCION

65-85% Mut

MUTACIONES aa SUBSTITUIDOS POR MUTACIONES PUNTUALES

Rev. per. med. exp. salud publica v.19 n.3 Lima jul./set 2002
Caracterizacin de las mutaciones en el gen rpo asociadas a la rifampicina en pacientes con tuberculosis pulmonar*
Juan Agapito1,2; Vctor Neyra1; Juan Castro1; Roberto Accinelli3; Isaas Rodrguez2; Jos R. Espinoza1.

CONTENIDO
I.
II.
III.
IV.

INTRODUCCION
TUBERCULOSIS Y CANCER
BASES MOLECULARES
MTODOS PARA EL
DIGNOSTICO MOLECULAR.

Maestra de Biologa MolecularUNMSM

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ROL DEL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA

I.

II.

III.

Contribuir al control y
tratamiento de la
tuberculosis
Deteccin precoz, rpida y
confiable.
Un aislamiento inicial de M.
tuberculosis debe ser

Mtodos actuales para

diagnstico
Procedimiento que permite detectar la resistencia
de M. tuberculosis a las drogas antituberculosas.

INDIRECTAS o
CONVENCIONALES
Se realiza a partir de
un cultivo positivo
Mtodo
Proporciones LJ
Mtodo
Proporciones en
Agar en Placa (APP)

DIRECTAS o RPIDAS
Se realiza a partir de
muestras de esputo
BACTEC 460TB
BACTEC MGIT 960
GRIESS
MODS
Mtodos Moleculares

METODO
MOLECULARES
PR
UE
BA
S
DE
SU
SC
EP
TIB
ILI
DA
D

Alternativa precisa y rpida de

identificacin.
Existen gran variedad de
tcnicas y con diferentes
niveles de aplicacin.
Deteccin de M tuberculosis
de muestra clnica
Requieren una alta inversin
para su implementacin.

Mtodos
moleculares
basado en PCR:
Geno Type MTDR
plus
Gene Xpert

Deteccin Directa de MTBC en

muestras clnicas; Tests de
Amplificacin de cidos Nucleicos
(AAN)
Objetivo: detectar/identificar MTB.
Tiempo de respuesta de 24-48 hrs.
Resultado Positivo demuestra la
presencia de MTB.
No distingue bacilos vivos y
muertos
Resultado Negativo no necesariamente
significa ausencia de MTB.
Inhibicin de la amplificacin
Blanco por debajo del lmite de
deteccin.

Tests de Amplificacin de cidos

Nucleicos (AAN) para deteccin
de MTBC

Aprobados por la FDA para su

uso:
Amplified MTD
(Mycobacterium tuberculosis
Direct) test: Gen-Probe.
Genotype MTBDR, Hain
Lifescience.
Cepheid GeneXpert

Diagnstico de TB por Tests de

Amplificacin de cidos Nucleicos
(NAAT)
Standard en la practica
NO reemplaza el juicio clnico; NO
significa la nica gua para el aislamiento
o terapia.
Sensibilidad:
95% para pacientes BAAR
positivos.
55-75% en pacientes BAAR
negativo, cultivo positivo.
Resultado mejora con alta sospecha
clnica de TB

Limitaciones y
Consideraciones
Sensibilidad

Reducida muestras frotis NEG y algunos tipos

de muestra.
Para confirmar o descartar la enfermedad.
Plataforma dependiente

Especifidad

Plataforma dependiente

No reemplaza la necesidad de cultivo

Cultivo necesario para PS convencional y

genotipificacin.

Contaminacin cruzada de los amplicones

en Sistemas abiertos.
Costo y sostenibilidad

Cepheid Xpert MTB/RIF

Sistema comercial automatizado para
la identificacin de MTBC y mutaciones
en rpoB
PCR tiempo real con sondas
moleculares beacons
5 sondas para RRDR en rpoB y 1 sonda
para control de amplificacin

Descontaminacin, digestin,
extraccin de ADN, amplificacin y
deteccin en el mismo cartucho;
requerimientos de BS son limitados.

Cepheid Xpert MTB/RIF

Secuencia blanco de la regin del ncleo del gen rpoB y tecnologa molecular beacon
(A) Gen rpoB, secuencia de nucletidos de la regin del ncleo y localizacin de las
sondas molecular beacon que cubren la regin del ncleo completa.
(B) Estructura del molecular beacon, establecimiento de la fluorescencia despus de
su unin al ADN complementario. La estructura en anillo contiene la secuencia
sonda de oligonucletidos complementario; el quencher y el fluorforo estn
adheridos al final de la estructura. Despus de la hibridacin se produce un cambio
conformacional de la sonda que lleva a la separacin del fluorforo y quencher, que
resulta en fluorescencia.
Future Microbiol. 2011 September; 6(9): 10671082.

Cepheid Xpert MTB/RIF

-- GGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTG --

5 sondas Cada sonda tiene un color diferente de

fluoroforo
2 o ms sondas = Mycobacterium tuberculosis

Prdida de 1 sonda = Resistencia a Rifampicina

Cepheid Xpert MTB/RIF

Ventajas
Desventajas
Muestras NO
Requiere varias
procesadas
sondas para cubrir
Ensayo rpido
regiones que se
Plataforma multiuso
solapan
Proceso automatizado
Mutaciones silentes
Sistema cerrado
resulta F resistencia
Lmite de
No configurable por
deteccin:131CFU/ml
usuario.
esputo.
No rx cruzada con MNT
Recomendacin OMS
Muestras clnicas
Aislamientos (NO ADN extrado / ni cels. Lisadas)

MUCHAS GRACIAS