A O D E L A D I V E R S I F I C A C I O N P R O D U C T I VA Y D E L

F O RTA L E C I M I E N T O D E L A E D U C A C I O N

Universidad Nacional de
FACULTAD
DE CIENCIAS
Piura

ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS

BIOLOGICAS
PROFESOR: Ing. ROBERTO Mendoza
Rendn
A LU M N O S : A R A N D A A LV A R A D O
JONATHAN

SEMINARIO N* 7 :
EXPERIMENTO DE KORNBERG
REFERENTE A LA COMPOSICION DE
LA S B A S E S D E L A D N

BREVE INTRODUCCION AL EXPERIMENTO DE ARTUR KORNBERG :

Fue un bioqumico estadounidense.
Nacido en Brooklyn el 3 de marzo de
1918, estudi en el City College de
Nueva York y obtuvo el ttulo de
graduado en Medicina por la
Universidad de Rochester en 1941,
siendo despus alumno interno en el
Strong Memorial Hospital en
Rochester.
Desde 1942 hasta 1952 trabaj en los
laboratorios de los Nacional Institute of
Health (NIH), haciendo algunas
estancias en otros centros de
investigacin. Una de ellas fue en la
Universidad de Nueva York para
trabajar con Severo Ochoa, con quien
compartira, posteriormente, el Premio
Nobel de Fisiologa o Medicina (1959).

Arthur Kornberg (Brooklyn,

Nueva York, 3 de marzo de
1918 - 26 de octubre de
2007)

Objetivo del experimento :

Su objetivo fue lograr la sntesis de cidos
nuclicos fuera de la clula viva, utilizando como
patrn ADN natural, generando asi un ADN
completamente sinttico que posea las mismas
propiedades que el material nativo.

Hiptesis de la investigacin :
Hiptesis sobre la aplicacin de los tomos radiactivos:
Esta hiptesis se basa en el uso de tomos radiactivos para
marcar el nucletido, de modo que incluso en pequeas
cantidades, pudiramos detectar su incorporacin en el cido
nuclico.
Lamentablemente los sistemas enzimticos para la sntesis
del acido nucleico, encontrados en extractos de timo, mdula
sea y clulas bacterianas, poseen una potente actividad para
degradar los cidos nucleicos, y por esta razn agregaron los
nucletidos marcados a un conjunto de cidos nucleicos,
porque aunque en la mezcla hubiera destruccin neta de
cidos nucleicos, podra detectarse la sntesis de unas pocas
molculas atrapadas en el conjunto.

Hiptesis de la precipitacin de cidos nucledos:

La precipitacin de los cidos nucleicos permite su
purificacin y concentracin. Se basa en la
simultnea neutralizacin de las cargas negativas
(mediante el aadido de sales), y deshidratacin de
la molcula (mediada por el agregado de alcoholes,
tpicamente etanol o isopropanol ), lo cual lleva a su
precipitacin.

La precipitacin es un fenmeno reversible

(mediante la disolucin en soluciones acuosas) y no
debe ser confundido ni con la desnaturalizacin
(potencialmente reversible) ni con la degradacin
(irreversible) de los mismos.

Hiptesis del Anlisis del vecino ms prximo:

Esta determina la frecuencia relativa con que
dos nucletidos resultan unidos lateralmente
en una molcula de ADN sinttico. Hay en
total 16 combinaciones posibles y, de ellas,
cuatro secuencias posibles de vecinos ms
prximos de Adenina (Adenina Adenina,
Adenina Guanina, Adenina Timina y Adenina
Citocina ), cuatro de Guanina ( Guanina
Adenina, Guanina Guanina, Guanina Timina,
Citocina Guanina) y, anlogamente, cuatro de
Timina y cuatro de Citocina.
Este anlisis consiste en utilizar primero,
durante la sntesis, un trifosfato marcado con
un atomo de fosforo radiactivo y tratar
despus el ADN sintetizado con una enzima
especifica que rompa el ADN, dejando el
tomo de fosforo radioactivo unido a su
vecino ms inmediato.

Hiptesis del Broche:

Dado el problema en el cual el ADN polimerasa no se sabia
si podra ser posible que se orientase a si misma e iniciara la
replicacin sobre un moldede ADN que no tenia extremos,
como el del virus bacteriano de lazo cerrado X174.
Por su apariencia en las imagines obtenidas por el
microscopio electrnico del virus X174 si preguntaban si
solo era realmente un simple lazo, con el hecho de que
pareca un collar con broche, en el que cuya composicin
intervenan sustancias no relacionadas con los nucletidos.
Por el trabajo de Sinsheimer, en el que el ADN del X174
tenia que constituir un lazo completamente cerrado para ser
infeccioso, y conocan tambin que su polimerasa solo poda
catalizar la sntesis de molculas lineales de ADN.

Investigando mas sobre el problema, pudieron

encontrar una enzima unidora de polinucleotidos
que tiene la capacidad de reparar mellas en la
cadena de ADN. Las mellas ocurren donde hay
rotura en la columna vertebral azcar-fosfato de
un filamento de la molcula de ADN. La enzima
solo puede reparar una rotura cuando todos lo
que falta es el enlace covalente entre un azcar y
su fosfato vecino en el espinazo del ADN.

Metodologa del experimento :

a.- Materiales:
* El virus X174: que posee una cadena sencilla en
forma de lazo cerrado.
* Bacteria Escherichia coli: que al ser infectada por el
virus QX174 el lazo de la cadena sencilla de ADN
acta de molde dirigiendo la sntesis enzimtica de
un segundo lazo de ADN sinttico. Los dos lazos
forman una doble hlice anular, similar a las hlices
de ADN que se encuentran en las clulas bacterianas
y en los organismos superiores.

 * Enzimas celulares: con la ayuda deesta Kornberg

pudo realizar sus experimentos, estas son usadas
como catalizadores.
* Enzimas purificadas: ayudan en la sintetizacin de
grandes molculas en sistemas libres de clulas,
junto con las coenzimas.
* Coenzimas: ayudan en la sintetizacin de grandes
molculas en sistemas libres de clulas.
* Bromouracilo: se necesito cambiar la timina por 5
bromouracilo, que contiene un tomo de bromo (Br)
en el lugar de la timina que lleva un grupo de CH3
siendo mas ligero, para as marcar el ADN sintetico.

 * tomos radiactivos, para

marcar el nucletido.
* Desoxitimidina: compuesto
radiactivamente marcado q
fue incorporado al ADN por
clulas de medula osea y
otras clulas animales, en los
primeros ensayos de
Kornberg.
* Tubo de ensayo: contenedor
de vidrio para realizar
mezclas.

 b.- Experimentacin:

* La sntesis del ADN del virus X174, se consigui a

travs de los siguientes pasos:

1.- Se utiliz como molde el ADN circular de cadena

sencilla, marcado con tritio del X174.

2.- Se le aadieron junto con ADN polimerasa, nucletidos

activados de Adenina, Guanina, Citocina y, en lugar de
Timina, 5 bromouracilo. Uno de los nucletidos activados
se marco con fosforo radioactivo. El ADN sintetizado sobre
molde era completo, pero todava no constitua un lazo
cerrado.

3.- La unin de los extremos del lazo se efectuo aadiendo

la enzima de cierre.

 4.- Ahora se aadi suficiente nucleasa para conseguir la

rotura de una de las cadenas en aproximadamente la mitad
detodas las cadenas dobles.

5.- Esto dio lugar a una mezcla de lazos dobles completos,

lazos del molde, lazos sinteticos, cadenas lineares del molde y
cadenas lineares sinteticas. Puesto que las cadenas sintticas
contenan 5 bromouracilo eran ms pesadas que las cadenas
del molde y pudieron ser separadas que las cadenas molde y
pudieron ser separadas por centrifugacin.

6.- Los lazos sintticos fueron ahora aislados y utilizados como

moldes para hacer lazos dobles completamente sintticos.
* Para poder marcar el ADN sinttico se puede sustituir la
timina por 5 bromouracilo, que contiene un tomo de bromo
(Br) en el lugar en que la timina lleva un grupo de CH3,
haciendo mas ligero el ADN.

Resultados de la investigacin :
En las experimentaciones de Kornberg y sus
colegas tuvieron hallazgos importantes para
lograr su objetivo que luego revolucionara la
ingeniera gentica.
Se demostr que el ADN sinttico era una
molcula con la estructura qumica tpica del ADN
y con la misma proporcin de pares AdeninaTimina y Guanina-Citocina que el ADN utilizado
como patrn para dirigir la reaccin.
.

 Al examinar las propiedades fsicas del ADN sinttico, observ

que tena la alta viscosidad, la comparativamente lenta
velocidad de sedimentacin y otras propiedades fsicas tpicas
del ADN natural. El ADN nuevo era por tanto como el natural,
una molcula polimrica larga y fibrosa. Adems, cuanto mas
tiempo se dejaba incubar la mezcla de los ingredientes
activos mayor era la viscosidad del producto, lo cual era
unaprueba directa de que el ADN sinttico continuaba
creciendo en longitud y en cantidad.
Se realizaron tambin varias tcnicas para comprobar la
funcionabilidad del ADN sinttico; una de ellas se le llama
Anlisis del vecino mas prximo. De este anlisis se dedujo,
entre otras cosas, el reconocimiento de un hecho bsico sobre
la estructura de la doble hlice, La direccin de la cadena de
ADN sintetizada durante la replicacin era opuesta a la de su
molde. Por inferencia podemos concluir que las cadenas de la
doble hlice del ADN natural tienen que discurrir en
direcciones contrarios, como propusieron Watson Y Crick.

 Sin embargo la exactitud del anlisis de la

frecuencia de vecinos ms prximos no puede ser,
aunque este se efectu con el mismo cuidado,
superior al 98 por ciento. Consecuentemente,
continuaron desconfiados respecto a la precisin
de la copia de cadenas conteniendo, segn la
longitud de los genes 1.000 o ms nucletidos

Antecedentes de la investigacion :
El Doctor Arthur Kornberg: bas su trabajo sobre un
estudio anterior realizado por l mismo, en el cual ,a
partir de 60 Kg de Escherichia coli, logr obtener
miligramos de una enzima que l denomin ADN
polimerasa; sta era capaz de sintetizar una nueva
cadena de ADN a partir de una cadena existente
empleando nucletidos trifosfato.
Esta enzima cataliza la produccin de nuevas
cadenas de ADN, adems mostr cmo una sola
hebra de ADN forma nuevas cadenas de nucletidos,
y demostr la estructura de doble hlice del ADN.

 Podemos concluir con que

Kornberg descubri una
enzima en la bacteria
intestinal Escherichia coli,
la ADN polimerasa, con la
cual sintetiz por primera
vez cido
desoxirribonucleico (ADN )
en el tubo de ensayo, lo
que le vali el Nobel que
comparti con su maestro
y amigo el cientfico
Severo Ochoa.

Datos Curiosos :
Algo curioso que
descubrimos mientras
realizbamos el trabajo fue
la longevidad del Dr.
Kornberg, ya que muri a
la edad de 89 aos, y que
al igual su hijo llamado
Roger David Kornberg
obtuvo un Premio Nobel,
Kornberg lo obtuvo en
Medicina en 1959 mientras
que su hijo en el rea de
Qumica en el 2006.

Roger David Kornberg(

St. Louis,Missouri,USA,
24 de abrilde1947)