Citometra de flujo

Viviana Valds Ramrez

Sarita Meza Meneses
Lizeth Josa

INTRODUCCIN
La citometra de
flujo se inici en la
dcada de los 60
como un importante
avance en el proceso
de contar y medir el
tamao de partculas
o clulas en
poblaciones no
homogneas.
Tomado de:
Universidad Javeriana. (s.f.). Biologia Celular. Recuperado el 15 de Noviembre de 2014, de
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/citometria.htm

Citmetro de flujo
Aparato que es capaz de medir
componentes y propiedades de
clulas y organelos celulares
(partculas biolgicas) que
fluyen en una suspensin
celular.

Los sorters tienen las mismas

prestaciones y posibilidades
que los citmetros de flujo pero
con la capacidad adicional de
separar partculas
selectivamente
Tomado de:
Universidad Javeriana. (s.f.). Biologia Celular. Recuperado el 15 de Noviembre de 2014, de
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/citometria.htm

CITOMETRA DE FLUJO
Su fundamento se basa en hacer
pasar una suspensin de
partculas (generalmente clulas)
alineadas y de una en una por
delante de un haz de lser
focalizado.

La citometra de flujo es un proceso

que permite la medida simultnea de
mltiples caractersticas fsicas de
una sola clula. Estas medidas son
realizadas mientras las clulas
(partculas) pasan en fila, a una
velocidad de 500 a 4000 clulas por
segundo, a travs del aparato de
medida en una corriente de fluido.

(Resino, 2014)

OBJETIVOS PRINCIPALES DE LA
CITOMETRIA DE FLUJO

Identificar y enumerar
subpoblaciones
celulares nicas y
definidas.

(Resino, 2014)

Medir capacidad
funcional de
subpoblaciones
celulares definidas

Seleccionar y separar
fsicamente
subpoblaciones de
clulas deseadas (por
deflexin
electrosttica; esta
tecnologa de
separacin se llama
"electronic cell
sorting")

APLICACIONES
y el

La CMF se puede
emplear para estudiar
caractersticas
estructurales y
funcionales de clulas o
partculas en suspensin.

Estudio del contenido de

ADN y fases del ciclo
celular.

Las aplicaciones
fundamentales de esta
tcnica se dan en
biologa y medicina y son
la identificacin de:

Antgenos celulares
mediante tcnicas de
inmunofluorescencia.

(Resino, 2014)

La CMF se ha utilizado
En hematologa: contaje celular, frmula leucocitaria, contaje
reticulocitario, anlisis de mdula sea.
En farmacologa: estudios de cintica celular.
En inmunologa: subpoblaciones T, tipaje tisular,
estimulacin linfocitaria.
En oncologa: diagnstico/pronstico, monitorizar
tratamiento.

En microbiologa: diagnstico bacteriano y vrico, sensibilidad

a antibiticos.
En gentica: cariotipo, diagnstico de portador, diagnstico
prenatal.

(Prez, 2012)

El diagnostico de leucemias y linfomas

mediante deteccin de clulas.

El seguimiento de marcadores
pronsticos como las cuentas de
linfocitos CD4 en pacientes con
infeccin por HIV

La determinacin de la eficacia de
tratamientos antitumorales e
inmunosupresores

Estudio de la heterogeneidad de las

clulas sanguneas o de otros tejidos:
Neoplasia, inmunodeficiencias
congnitas y adquiridas,
Monitorizacin del efecto de terapia
inmunosupresora en pacientes
trasplantados

Estudio de la ploidia y proliferacin

celular

(Prez, 2012)

Sistema necesario del citmetro

Fluidos. La muestra que ser
analizada

ptica. Es una fuente de excitacin y

un sistema de coleccin para generar
y recoger las seales luminosas.

Electrnica. Para convertir las seales

pticas en seales electrnicas
proporcionales y digitalizarlas para
anlisis computacional

(Prez, 2012)

Sistema hidrulico
Controles neumtico
y fluidos para
establecer un flujo
laminar que permita
a la suspensin
celular atravesar la
cmara de flujo.

Tomado de:
Universidad Javeriana. (s.f.). Biologia Celular. Recuperado el 15 de Noviembre de 2014, de
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/citometria.htm

Sistema ptico
Lser. Argn con
luz
monocromtica

SISTEMA
ELECTROINFORMA
TICO. Convierte la
luz dispersa en
seales elctricas
y las procesa para
su anlisis.

Tomado de:
Universidad Javeriana. (s.f.). Biologia Celular. Recuperado el 15 de Noviembre de 2014, de
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/citometria.htm

Parmetros
Caractersticas
morfolgicas de la
clula : tamao y
complejidad del
citoplasma

Caractersticas
antignicas de la
clula: Inmunofenotipo.

(Prez, 2012)

El citmetro de flujo detecta como las clulas

interactan con un rayo lser en trminos de
cmo la clula :

a) Desva la luz incidente

b) Emite fluorescencia

las propiedades de
dispersin de la luz en una
clula nos da informacin
acerca del tamao celular y
granularidad.

(Prez, 2012)

FLUORESCENCIA
Un fluorocromo es
una molcula qumica que
absorbe la luz a una
determinada longitud de onda
(energia ) energa de excitacin
y emite a una longitud superior
(menor energia).

Interacciona con la luz de

excitacin procedente de el
lser.

Se utiliza unido a anticuerpos

especficos (monoclonales )
para antgenos de la clula.

La cantidad de fluorescencia con

la cual una clula se tie es
proporcional a la cantidad de
sitios de unin.

(Prez, 2012)

Fluorocromos
Ofrecen un mtodo sensible para obtener informacin
acerca de la estructura, funcin y vitalidad de las clulas.
Modo de uso:

Unin covalente del fluorocromo a molculas que se

unen especficamente a componentes celulares

Fluorocromos varan sus caractersticas en funcin del

microambiente que les rodea.

(Prez, 2012)

Propiedades de un fluorocromo
Alto coeficiente
de extincin a la
longitud de
onda de
excitacin
(probabilidad de
absorber la luz)

Elevada
fotoestabilidad

Alto rendimiento
cuntico
(emisin de luz)

(Prez, 2012)

Corto estado de
excitacin.

Cmo se obtiene la luz

fluorescente.
Unin de sitios especficos con anticuerpos marcados con
fluorocromos.
El fluorocromo absorbe energa del lser.
El fluorocromo libera energa absorbida por:

a) Vibracin y disipacin del calor.

b) Emisin de fotones a una mayor
longitud de onda
Llamada fluorescencia.
(Prez, 2012)

El fluorocromo ms empleado
es la FLUORESCEINA. Otros que
se han descrito y empleado son:

rodamina, Texas red, cianinas,

pero el ms famoso es la
PICOERITRINA (ficobiliprotena)
por su gran absorcin,
rendimiento y fotoestabilidad.

Actualmente se ha generalizado
el estudio multiparamtrico de
antgenos celulares con el
empleo simultneo de 3 y 4
anticuerpos conjugados cada
uno con fluorocromos con
diferente longitud de emisin
(Prez, 2012)

REALIZACIN DE
CITOMETRIA DE FLUJO

Se hace en 3 etapas independientes :

Fase pre-citometra:
preparacin de los reactivos,
preparacin de las clulas,
diseo del protocolo y
coloracin de las clulas con
los reactivos fluorescentes.

Fase de citometra de flujo :

involucra el procesamiento de
las clulas marcadas y la
recoleccin de los datos para
cada una de las medidas
(parmetros) realizados en
cada clula individual.

Fase de anlisis: anlisis de

los datos recolectados

(Prez, 2012)

Procesamiento:
La mezcla de clulas teidas con diferentes
fluorocromos es forzada a pasar a travs de
una aguja creando una delgada fila de lquido
que contiene las clulas.
A medida que cada clula pasa en frente del
lser, desva el rayo incidente y las molculas
teidas unidas a la clula van a ser excitadas
y emiten luz fluorescente.
Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la
luz desviada y las emisiones fluorescentes, la
informacin es digitalizada y procesada por el
computador.
Los resultados son presentados a manera de
histogramas o "dot-plots".

(Kenneth, Travers & Walport, 2009)

Figura tomada de:

(Kenneth, Travers & Walport, 2009)

Resultados
Dot-plots

Histogramas

Tomado de: (Kenneth, Travers &

Walport, 2009)

ENSAYO DE CAPTURA DE SECRECIN

Se ha utilizado para
cuantificar la secrecin de
citoquinas a partir de
linfocitos T

El procedimiento utilizado
es: Encapsulacin de la clula
en una microgota de agarosa
con biotina

Incorporacin de un
anticuerpo dirigido contra la
citoquina que queremos
detectar

Unin no especfica y
retencin del anticuerpo en
la matriz de agarosa

Incorporacin de un segundo
anticuerpo que reconoce la
unin antgeno- anticuerpo
ya formada. Este segundo
anticuerpo est marcado con
un fluorocromo

Las microgotas se analizan en

el citmetro, midiendo la
fluorescencia emitida por el
fluorocromo, que es
proporcional a la unin
antgeno-anticuerpo

Tomado de:
Universidad Javeriana. (s.f.). Biologia Celular. Recuperado el 15 de Noviembre de 2014, de
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/citometria.ht
m

DETERMINACION DEL CONTENIDO

CELULAR DE DNA

Una suspensin de clulas

es coloreada con un
colorante fluorescente que
se une con el DNA. La
cantidad de colorante
unido es entonces
proporcional a la cantidad
de DNA. Las clulas
coloreadas se introducen
entonces en el citmetro y
la luz fluorescente emitida
es proporcionarle al
contenido de DNA de cada
clula.
Tomado de: SEDAI de Citometra.
Departamento de Medicina

FAGOCITOSIS
Neutrfilos,
monocitos y
macrfagos.
Favorecido cuando
los Mo estn
recubiertos por IgG
o fraccin del C
CD11b receptor
para C3b

CD16receptor
para Fc IgG
CD15ligando para
selectina

Tomado de:
http://www.lablasamericas.com.co/site/index.php/examen/fagocitosis__citometria_de_flujo_/

VENTAJAS DE LA
CITOMETRIA DE FLUJO
Anlisis de un nmero
estadsticamente
significativo de clulas
(1000 a ms de 100.000
clulas).

Mltiples marcajes de
una sola clula.

Anlisis de alto numero

de partculas en corto
tiempo (5.000 eventos
/seg).

Medidas cuantitativas :
discriminacin de las
clulas segn la
cantidad de marcador.

Medidas separadas de
cada clula (no slo el
promedio).

Alta sensibilidad y
objetividad.

Mltiples parmetros :
define subpoblaciones
complejas.

Miles de clulas por

segundo

(Resino, 2014)

DESVENTAJAS DE LA
CITOMETRIA DE FLUJO
Poca informacin morfolgica de la clula

No proporciona informacin de la localizacin celular en un tejido

Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones
de clulas / hora)

Necesita suspensin de clulas individuales.

Costos de la tecnologa

Mtodo destructivo.

Incapacidad de visualizar las clulas que se analizan.

(Resino, 2014)

Bibliografa

Murphy K, Travers P, Walport M. Inmunologa de Janeway. 7a Ed. McGraw-Hill

Interamericana de Editores S.A, 2009

Prez, J. (2012). Fundamentos y aplicaciones de la citometra de flujo. Recuperado

el 15 de Noviembre de 2014, de
https://www.uclm.es/irec/divulgacion/seminarios/JoseManuelPerezLastra.pdf

Resino, S. (2014). Epidemiologa Molecular De Enfermedades Infecciosas.

Recuperado el 14 de Noviembre de 2014, de
http://epidemiologiamolecular.com/citometria-flujo/

Universidad Javeriana. (s.f.). Biologia Celular. Recuperado el 15 de Noviembre de

2014, de
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/
citometria.htm
Laboratorio Medico Las Amricas. Recuperado el 14 de Noviembre de 2014, de
http://www.lablasamericas.com.co/site/index.php/examen/fagocitosis__citometri
a_de_flujo_/
SEDAI de Citometra. Departamento de Medicina. Universitat de Lleida Recuperado
el 14 de Noviembre de 2014,
de http://web.udl.es/dept/medicina/sedaicmf/sedai/adn.htm