LABORATORIOS MOLECULAR

II CORTE

DALIANA MORALES, DINA

BARRERA, LEIDY LPEZ,
MARA CARABALLO,
MANUELA RUIZ, VIELKA
BARRIOS.

INTRODUCCIN
Cuando las clulas se encuentran en estado de metafase durante la
divisin celular, el ADN condensado en forma de cromosomas
puede ser visualizado en forma directa con la ayuda de equipos de
microscopia de luz no muy complicados. AISLAMIENTO O
EXTRACCIN DE ADN
Rompimiento del material inicial, ya sea de origen viral, bacteriano,
vegetal o animal. La lisis se puede hacer por accin mecnica,
pulverizando el tejido con hielo seco o nitrgeno lquido, tambin
se puede utilizar la degradacin enzimtica de la pared celular (si
est presente) y lisis con detergentes de las membranas celulares.

Desproteinizacin, lo cual se lleva a cabo con un solvente orgnico,

seguido de una precipitacin con isopropanol o etanol y posterior
solubilizacin con agua o tampn

AISLAR ADN DE BACTERIANO

Tubos eppendorf
Micropipetas
Puntas
1ml cultivo bacteriano
Hipoclorito
Solucin de lisis
Centrifuga
Solucin de RNasa
Incubadora
Hielo
Solucin de precipitacin de protenas
Isopropanol
Etanol al 70%
Solucin de rehidratacin

Metodologa

1ml del cultivo

10 min a 5000 x g.

10 min (80C)
agitamos 5 min

500ul de sln de lisis

Descarto
sobrenadante en
hipoclorito

4ul de sln RNasa

incubo a 37C
(20min)

separ en 2 T.
eppendorf.

200 ul de sln de
prec de protenas

10 min

800 ul de etanol al 70%

14000 X g por 5 min.

14000 X g por 10 min,

descartamos el sobrenadante.

Se transfiri el sln a tubos

limpios (600 ul de
isopropanol)

10 min

centrifug por 2 min a

14000 X g.

Se aspir el etanol y se
dej secar
por 10 minutos

100 ul de solucin de
rehidratacin.
guard a 4C

RESULTADOS Y DISCUSIN
Solucin de lisis contiene amortiguadores y detergentes
que ayudan a lisar la clula o romper la membrana celular,
sin hacerle dao al ADN.
Solucin de Rnase es una nucleasa que cataliza la
degradacin del RNA en componentes ms
pequeos.
Solucin de precipitacin de protenas ayuda a la
degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN y
el hielo ayuda a cristalizarlo.
El isopropanol y etanol ayudan a purificar o
concentrar el ADN.

CONCLUSIN
Las

bacterias

contener

no

suelen

substancias

inhibidoras, por lo que en la

mayora

de

casos

una

extraccin primaria (lisis y

liberacin
suficiente

del

ADN)

para

es

tener

resultados satisfactorios.

INTRODUCCIN
Para estudiar el ADN de un mosquito es necesario extraer un
ADN puro y de buena calidad.
Se han empleado varios mtodos utilizando
fenol cloroformo
Solventes orgnicos

Contamina el producto de la
extraccin e inhibir la amplificacin.

Al realizar el mtodo de extraccin sin fenol se evitan las

desventajas del mtodo con fenol, adems es menos costoso y se
disminuye tiempos gracias al acetato de potasio.

OBJETIVOS
Aislar el material gentico de
clulas eucariotas, provenientes
de un espcimen de mosquito

Conocer las ventajas de extraer

ADN en ausencia de fenol

Establecer diferencias entre el

tipo de extraccin de DNA de
clulas eucariotas y procariotas

MATERIALES Y REACTIVOS

PROCEDIMIENTO
Se realiz la diseccin de
patas, alas y cabezas de 3
mosquitos.

Se
colocaron en un tubo de
eppendorf las alas, los abdmenes, y
las patas los mosquitos.

Se adicionaron 50 l de
buffer
de
lisis
para
homogenizar

Se macero bien, hasta

muestra se homogenizo.

Seguidamente se incubo el
pellet por 15min a 65C

que

la

Se le agrego15 ul de acetato de
potasio y se mezcl suavemente por
inversin.

Seguidamente se incubo en hielo

durante 15 minutos.

Se centrifug a 13000 R.P.M. por

15 min, a 4C

RESULTADOS Y DISCUSIN
No se utiliz la cabeza
porque
en
esta
se
encuentran las glndulas
salivales y esta se puede
haber mezclado con sangre
humana.
Buffer de lisis

Acetato de potasio

Impiden un ADN de buena

calidad y afectara a un
prximo anlisis
Rompe la membrana celular y
nuclear, permitiendo esto la
liberacin del ADN.

Precipita las protenas

Genera una compactacin de las

molculas dejando a las ms
pesadas en una fase inferior

Etanol absoluto

Purifica el DNA

CONCLUSIN

INTRODUCCIN
Las
clulas
vegetales
son
distinguibles de las clulas animales
por su pared celular rgida y
orgnulos como el cloroplasto.
Algunas clulas de las plantas son
poliploides, lo que significa que
tienen ms de una copia de cada
cromosoma por clula
El ADN de las clulas vegetal se
encuentra dentro del ncleo, pero
adems tienen dos orgnulos con su
propio
material
gentico:
las
mitocondrias y los cloroplastos

OBJETIVO
Familiarizar al estudiante en el uso del Kit de
Purificacin de ADN (PROMEGA) para obtener
ADN genmico y Realizar la extraccin de ADN en
tejido vegetal (Plntulas).

MATERIALES Y EQUIPOS
REACTIVOS DEL KIT PROMEGA
Nuclei Lysis Solution.
RNasa.
Protein Precipitation
Solution.
DNA RehydrationSolution

 Mortero y Mango de mortero.

Vortex.
Etanol 70%.
Isopropanol.
Nitrgeno Lquido.
Hielo.

Pipetas
Guantes.
Esptula.

Papel craf.
Plntulas

Se maceraron las hojas, el

pice, la raz y el tallo de la
plntula en nitrgeno lquido.

600l de Nuclei Lysis Solution

Y se Incubo a 65C durante 15
minutos.

se aadieron 3l de la solucin de
RNasa. Y nuevamente se incubo a
37 C durante 15 min. Y ms tarde
se incubo la muestra por 5 min a
T A.

200 l Protein Precipitation

Solution. Y vortex por 20
segundos.

Se centrifugo a 13000 rpm por 3mn

Se transfiri el sobrenadante a
un tubo nuevo que contena 600 l
de Isopropanol, se mezcl por
inversin y se centrifugo a 13000
rpm por 1 min.

Se descart el sobrenadante, y
se adicionaron 600 l de etanol al
70% a temperatura ambiente, y
se mezcl por inversin.

Se centrifugo nuevamente a
13000 rpm, por 1 min.

Se aspir el etanol y se dej

secar el pellet (15 minutos).

Seguidamente se le agrego al
ADN
100
l
de
DNA
Rehydration Solution.

El ADN genmico de las plantas es

ms difcil de extraer a causa de
la pared celular de la planta, que
se elimina por homogeneizacin o
mediante la adicin de celulosa
para degradar la celulosa

La solucin de RNasa evita la

presencia de cantidades
considerables de ARN en la
muestra

Macerar la plntula con Nitrgeno

Lquido ayuda a homogenizar la
muestra

La solucin de rehidratacin
suspende la muestra para su
posterior visualizacin en un
corrido de electroforesis.

El reactivo Nuclei Lysis (KIT

PROMEGA) sirve para romper el
ncleo de la Clula Vegetal

Para la realizacin de la extraccin de

ADN vegetal se tuvo en cuenta la
solucin ARNasa la cual permiti la
desintegracin

del

RNA

para

la

obtencin de ADN de tal manera que

se observar con la ayuda de los
compuestos aplicados al mismo.

GRACIAS !!!!!!!!!