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PARA ENTEROBACTERIAS
Susana Gonzlez Gurrola
3B
IDENTIFICACIN MICROBIANA
Se entiende por identificacin microbiana al conjunto de tcnicas y
procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un
microorganismo.
MTODOS DE IDENTIFICACIN
BACTERIANA
Los mtodos ms utilizados para la identificacin microbiana, los podemos
clasificar en:
1. Mtodos basados en criterios morfolgicos
2. Mtodos basados en tincin diferencial
3. Mtodos basados en pruebas bioqumicas
4. Mtodos basados en tipificacin con fagos
Sin embargo, aun cuando la morfologa celular dice poco sobre las
relaciones filogenticas, sigue siendo til para la identificacin bacteriana.
PRUEBAS BIOQUMICAS
Citrato
Ureasa
Voges-Proskauer
Rojo de metilo
Sulfuro Indol Movilidad (SIM)
Movilida, Indol, Ornitina (MIO)
Triple azcar Herro (TSI)
Agar Lisina Hierro (LIA)
COLOR: VERDE
PRINCIPIO
Es una sal del acido ctrico.
Algunas bacterias pueden obtener energa de fuentes distintas de la
fermentacin de los hidratos de carbono, con el citrato como nica fuente
de carbono.
MEDIO DE CULTIVO
El medio para citrato utilizado con mayor
frecuencia es la formula de Simmons.
Cloruro de sodio 5 g
Citrato de sodio 2 g
Sulfato de magnesio 0 ,20 g
Agar 15 g
PROCEDIMIENTO
Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento
primario y se siembra en forma de estra nica en el pico de flauta (agar
inclinado) del tubo de agar citrato.
El tubo se incuba a 35 C
durante 24 a 48 horas.
RESULTADOS
Microorganismos Positivos
Salmonella
Arizona
Citrobacter
Enterobacter
Klebsiella
Serratia licuefaciensis
Pseudomonas cepacia
Microorganismos Negativos
Edwarsiella
Yersinia enterocoltica
Escherichia coli
Shigella
Yersinia pseudotuberculosis
Ureasa
COLOR: ROSADO
INDICADOR: ROJO FENOL
SUSTRATO PRINCIPAL: UREA
PRINCIPIO
Es una diamida del acido carbnico
Todas las amidas se hidrolizan fcilmente, con liberacin de amoniaco y
dixido de carbono.
El amoniaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, lo que
produce alcalinizacin y aumento de pH del medio.
MEDIOS DE CULTIVO
Los dos medios utilizados con mayor frecuencia son el caldo urea de Stuart y el agar urea
de Christensen.
CALDO UREA DE STUART
AGAR UREA DE CHRISTENSEN
Extracto de levadura 0,1 g
Peptona 1 9
Fosfato monopotasico 9,1 g
Glucosa 1 g
Fosfato disodico 9,5 g
Cloruro de sodio 5 g
Urea 20 g
Fosfato monopotasico 2 g
Rojo fenol 0,01 g
Urea 20 g
Agua destilada 1 L
Rojo fenol 0 ,012 g
Agar 15 g
Agua destilada 1 L
pH final = 6,8
pH final = 6,8
PROCEDIMIENTO
El medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo
por probar.
RESULTADOS
1. Caldo de Stuart:
Un color rojo en todo el medio
alcalinizacin e hidrolisis de la urea.
indica
2. Agar de Christensen:
Microorganismos positivos
Klebsiella
Proteus (rpido)
Microorganismos negativos
Escherichia coli
Providencia
VogesProskauer
PRINCIPIO
Voges-Proskauer es un epnimo doble, en honor de dos microbilogos que
trabajaron a principios del siglo xx. Estos investigadores fueron los primeros en
observar la reaccin de color rojo producida en medios de cultivo
adecuados despus del tratamiento con hidrxido de potasio. Luego se
descubri que el producto activo del medio, formado por el metabolismo
bacteriano, es el acetil metil carbinol, producto de la va del butilenglicol.
MEDIOS DE CULTIVO
El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metiloVoges-Proskauer (MR/VP) segun la formula de Clark y Lubs.
A. Caldo VP/RM
B. Reactivos
Polipeptona 7g
Glucosa 5 g
a-naftol 5 g
Fosfato dipotasico 5 g
Agua destilada 1 L
pH final = 6,9
Hidroxido de potasio 40 g
Agua destilada 100 mL
PROCEDIMIENTO
Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo por
probar. Incubar 24 horas a 35 C.
Finalizada la incubacin, transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio.
Agregar 0,6 ml de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%.
Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orden. Agitar
suavemente el tubo para exponer el medio al oxigeno atmosfrico y dejar el
tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.
RESULTADOS
La prueba no debe leerse mas all de una hora despus de dejar los tubos en
reposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un
color cobrizo, que se puede interpretar como un positivo falso.
Microorganismos positivos
Klebsiella pneuminiae
Yersinia enterocoltica
Microorganismos negativos
Escherichia coli
K. ozaenae
Rojo de
Metilo
PRINCIPIO
El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4
(rojo). El pH al cual el rojo de metilo detecta los cidos es mucho mas bajo
que el pH correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo
bacteriolgicos. Por lo tanto, para provocar un cambio de color, el
microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades de acido del
sustrato de hidratos de carbono que se utilice.
La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la produccin de
acido, que requiere que los microorganismos positivos produzcan cidos
fuertes (lactico, acetico, formico) de la glucosa.
MEDIOS DE CULTIVO
El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metiloVoges-Proskauer (MR/VP) segn la formula de Clark y Lubs.
A. Caldo VP/RM
B. Reactivos
Polipeptona 7g
Glucosa 5 g
Fosfato dipotasico 5 g
Agua destilada 1 L
pH final = 6,9
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo en
estudio. Incubar el caldo a 35 C durante 48 a 72 horas (no menos de 48
horas).
RESULTADOS
Microorganismos negativos
Enterobacter aergenes
Enterobacter cloacae
Klebsiella
Microorganismos positivos
Escherichia coli
Especies de Yersinia
Indol
SIM: Sulfuro indol movilidad
MIO: Movilidad indol ornitina
PRINCIPIO
Es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido
triptfano.
La prueba del indol se basa en la formacin de un complejo de color rojo
cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del pdimetilaminobenzaldehido.
En la practica se utilizan medios combinados, como el medio de sulfuro indol
para motilidad (SIM), el medio para motilidad indol omitina (MIO) o el medio
indol nitrato.
Produccin de cido
sulfhdrico
Produccin de Indol
Movilidad
PRODUCCIN DE CIDO
SULFHDRICO
La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reaccin
de reduccin que da un sulfito y un sulfato.
El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato frrico de amonio
para producir un precipitado negro insoluble, sulfato ferroso.
PRODUCCIN DE INDOL
El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias
para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolactico.
MEDIOS Y REACTIVOS
Caldo triptofano (triptofano al 1%)
Peptona o digerido pancreatico de caseina (tripticasa) 2 g
Cloruro de sodio 0,5 g
Agua destila da 100 ml
Reactivo de Kovac
Alcohol amilico o isoamilico puro 150 ml
p-dimetilaminobenzaldehido 10 g
HCI concentrado 50 ml
Reactivo de Ehrlich
p-dimetilaminobenzaldehido 2 g
Alcohol etlico 190 ml
HCI concentrado 40 ml
PROCEDIMIENTO
Sembrar el caldo triptfano con el microorganismo por probar e incubar a 35
C durante 18 a 24 horas.
Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo haciendo
que se deslicen por la pared del tubo.
Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por el
agregado de 1 mL de xilol. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac.
RESULTADOS
cido sulfhdrico:
Positivo: ennegrecimiento del medio
Negativo: Sin ennegrecimiento
Indol:
Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio
Negativo: No se produce color /Color naranja en la superficie del medio
indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser precursor
de la formacin de indol.
Movilidad
Positiva: los organismos mviles migran de la lnea de siembra y se difunden
en el medio provocando turbiedad.
Negativa: Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la lnea de siembra.
Bacterias
Produccin H2S
Produccin Indol
Movilidad
Salmonella typhi
+/-
Salmonella
+/-
E. coli
+/-
Klebsiella
+/-
Enterobacter
Citrobacter
Shigella
+/-
+/-
MIO:
MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA
Composicin del medio:
Extracto de levadura
Peptona
L-Ornitina
Dextrosa
Agar
Agua
Indicador de pH: prpura de bromocresol
cido: amarillo pH 5.2
Alcalino: Prpura pH 6.8
Medio no inoculado: Prpura intenso brillante pH 6.0
PRINCIPIO
El MIO se utiliza para la identificacin de enterobacterias
sobre la base de movilidad, la produccin de ornitina
descarboxilasa e indol.
1. Descarboxilacin de ornitina
2. Produccin de indol
3. Movilidad
PROCEDIMIENTO
Inoculacin: picadura en forma vertical
Tiempo: 28-48 hrs
Temperatura 35 -37C
RESULTADOS
Ornitina descarboxilasa
Positivo: color prpura del medio
Negativo: color amarillo en el fondo del tubo que puede ser prpura al final
Indol:
Positivo: anillo rojo en la superficie del medio
Negativa: No se Produce color / Color naranja en la superficie del medio,
indica desarrollo de escatol
Movilidad:
Microorganismos ornitina
positivos
Especies de Enterobacter
Proteus mirabilis
Proteus morganii
Yersinia enterocolitica
Microorganismos ornitina
negativos
Especies de Klebsiella
Enterobacter aglomerans
Proteus vulgaris
Proteus rettgeri
Yersinia pestis
Yersinia pseudotuberculosis
Bacterias
Produccin Indol
Movilidad
Produccin H2S
Salmonella typhi
+/-
Otras Salmonellas
+/-
E. coli
+/-
+/-
Enterobacter
Citrobacter
+/-
+/-
Klebsiella
Shigella
MEDIO DE CULTIVO
Agar hierro de klinger (AHK)
Composicin:
Estracto de carne
Peptona
Lactosa
Sulfato ferroso
Tiosulfato de Na
Agua destilada
Extracto de levadura
Proteasa
Dextrosa
Cloruro de Na
Agar
Indicador: Rojo fenol
cido: amarillo
Alcalino: Rojo
Medio no inoculado: naranja rojizo, pH 7.4
PRINCIPIO
El cido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo fenol.
PROCEDIMIENTO
Inoculacin: picadura y estra en pico de flauta.
Tiempo: 18-24 hrs
Temperatura:35-37C
RESULTADOS
K/A:
fermentacin
de
glucosa
solamente
(Pico
de
flauta
alcalino/profundidad cida). Caracterstico de bacterias no fermentadores
de lactosa como Shigella.
A/A: fermentacin de glucosa y lactosa (Pico de flauta cido/ profundidad
cida). Caractersticos de E. coli y grupo Klebsiella-Enterobacter.
K/K: No fermentacin de glucosa y lactosa (pico de flauta
alcalino/profundidad alcalina). Caracterstico de bacterias no fermentadoras
como Pseudomas aeruginosa
Especie bacteriana
Superficie
Fondo
Gas
H2 S
Enterobacter
++
Klebsiella
++
E. Coli
Shigella
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi
Citrobacter
+++
Proteus vulgaris
+++
Providencia
+/-
MEDIO DE CULTIVO
Base de descarboxilasa de Moller
Composicin:
Peptona
Piridoxal
Citrato de amonio
Glucosa
Agar
Extracto de carne
L-lisina
Tiosulfato de sodio
Agua destilada
Indicador de pH: Purpura de bromocresol
cido: Amarillo pH 5.2
Alcalino: Prpura pH 6.8
Medio no inoculado: Purpura intenso brillante pH 6.0
PRINCIPIO
PROCEDIMIENTO
Inoculacin: por picadura y estra, inculo liviano.
Temperatura: 35-37C
Tiempo 18-24 hrs
RESULTADOS
A: cido
K: alcalino
N: neutra
Especie Bacteriana
Superficie
Fondo
Gas
H2S
E. Coli
K/N
+/-
Shigella
Salmonella typhi
+/-
S. paratyphi
+/-
-/+
Enterobacter clocae
+/-
Agar
sangre
Hemlisis alfa
Hemlisis beta
Hemlisis Gamma