Instituto Politcnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa

Mtodos cuantitativos
Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC)
Partes del equipo
Bernal Castaeda Bianca Edith
Domnguez Gmez Daniel
Enrquez Cerda Noem A.
Guevara Garca Amaris

Abril 6, 2010
Equipo para Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC)
Recipientes inhertes que suelen ser botellas de vidrio y tubos de tefln
provistos de aditamentos indispensables para eliminar los gases disueltos y
partculas que pudiera tener la fase movil
Depsitos para la fase movil


Elucin isocrtica: Separacin con disolvente de composicin constante

Elucin con gradiente: Se utilizan dos o tres disolventes de distinta polaridad y
se vara la composicin de forma continua o mediante etapas escalonadas.
Tipos de elucin
Elucin: Arrastrar mediante un lquido (o fluido) o solvente
sustancias adheridas o absorbidas
Eluyentes tpicos
Son necesarios para conseguir y regular la presin y velocidad de flujo de la fase
movil. Cuando la fase movil es una mezcla de solventes, la bomba se programa
para tomar los diferentes solventes en una proporcin determinada

Caractersticas
Generar presiones por encima de 6000 psi
Libre de pulsaciones
Intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min.
Reproducible
Resistente a la corrosin

Tipos:
Bombas reciprocas
Bombas de desplazamiento
Bombas neumticas
Sistemas de bombeo
Sistemas de inyeccin
Son vlvulas dosificadoras que permiten regular la aplicacin de la muestra
en volumenes de 5 a 500 l.
Columnas analticas

Acero inoxidable (hasta 10000 psi)
10-30 cm longitud
4-10mm dimetro interno
1-10m tamao de partcula
Columna
Precolumnas

-Se colocan delante de la columna para eliminar la
materia en suspensin ycontaminantes de las
disolvente.

-La composicin del relleno debe ser semejante a la
columna analtica
Contiene a las partculas de la fase estacionaria
Pelicular
Bolas de vidrio o polmero, no porosas y esfricas

Sobre su superficie se deposita una capa delgada
y porosa de slice, almina o una resina de
intercambio inico

Se utilizan ampliamente en las precolumnas

Partcula porosa
Micro-partculas de slice
Tipos de rellenos de la columna
Columnas de slice
Respondern a una propiedad de la fase mvil

Caractersticas deseadas

Sensibilidad adecuada
Estabilidad y reproducibilidad buenas
Respuesta lineal extendida a varios rdenes de magnitud
Tiempo de respuesta corto
Respuesta rpida e independiente del caudal
Manejo sencillo
Respuesta selectiva a algunos analitos
Tipos de detectores

Detector de absorbancia
Detector de fluorescencia
Detector de ndice de refraccin
Detector de dispersin de luz
Detector electroqumico
Detector por espectroscopia de masas
Detectores
Detectores de absorbancia (UV-VIS)
Celda de flujo en forma de Z

Para minimizar el ensanchamiento de
banda extra-columna, el volumen de las
cubetas debe ser lo menor posible de 1 a
10 micrmetros
Espectro de absorcin de un efluente
que contiene una mezcla
de tres esteroides tomado a intervalos
de 5 segundos mediante
un detector de series de diodos
Detectores de ndice de refraccin
El disolvente pasa a travs de la mitad de una celda y el efluente
de la columna pasa por la otra mitad.

Caractersticas
Los dos compartimentos estn separados por una placa de vidrio montada a un
ngulo tal que si las dos disoluciones difieren en ndice de refraccin se produce una
desviacin del haz incidente.

Responden a casi todos los solutos
Son muy sensibles a la temperatura
Poco sensitivos.
Sistema para el tratamiento de datos
Es indispensable para registrar los cambios en alguna propiedad en funcin del
tiempo. La representacin grfica de estos registros se llama crometograma.

En estos registros aparece una serie de picos simtricos sobre el eje de los
tiempos para la identificacin cuantitativa (rea bajo los picos) y cualitativa
(posicin en el eje) de los componentes de una muestra.