CROMATOGRAFIA

Dra. Ximena Solano A.

CONCEPTOS BASICOS
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los componentes
que se han de separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales est en
reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras que la otra (fase mvil, F.M.) se mueve en
una direccin definida.
En todas las separaciones cromatogrficas la muestra se disuelve en una fase
mvil, que puede ser un gas un lquido o un fluido supercrtico.
Esta fase mvil se hace pasar a travs de una fase estacionaria inmiscible, la cual
se mantienen fija en una columna o sobre una superficie slida.
Las fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se
distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria.
Aquellos componentes que son retenidos con ms fuerza por la fase estacionaria
se mueven lentamente con el flujo; por el contrario los componentes que unen
dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia
de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas
discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente
CONCEPTOS BASICOS
Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su
movilidad entre s y con respecto a la fase mvil. La base de la separacin
cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la migracin de los
mismos.

CONCEPTOS BASICOS
Los fenmenos rectores del proceso de retencin y separacin son la
adsorcin y la absorcin.
1. El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a
la fijacin o retencin de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se
relaciona con fuerzas qumicas y fsicas que dependen de la naturaleza
de la sustancia adsorbida, temperatura, naturaleza del adsorbente y
concentracin.
2. El segundo fenmeno determina la retencin de una especie qumica por
parte de una masa y depende de la tendencia que tiene sta a formar
mezcla o reaccionar qumicamente con la misma.
MECANISMOS
Los principales mecanismos que intervienen en la separacin
cromatografica son:
1. Adsorcin: Gases o lquidos contenidos en la fase mvil son retenidos por
una adsorcin selectiva en la superficie del slido que constituye la fase
estacionaria.
En la interfase slido-fase mvil hay un aumento de concentracin respecto a
la inicial. Este mecanismo controla la cromatografia gas-slido y lquido-
slido.
2. Reparto: Los componentes de la fase mvil son retenidos por la fase
estacionaria liquida en funcin de su solubilidad en ella.
Intercambio Ionico: La fase estacionaria constituida por un slido
intercambiando iones con iones contenidos en la fase mvil, liquida.
El intercambio de iones slido-solucin esta regulado por la afinidad quimica
de los iones con ambas fases y por sus respectivas concentraciones.

MECANISMOS
3. Tamao Molecular: Especies neutras de alto peso molecular pueden ser
separadas en virtud de su tamao donde la fase estacionaria es un gel
hidrofilico altamente poroso que retiene las molculas de menor tamao
al de los poros.
4. Las molculas de mayor tamao son retardadas en su paso por pequeas
fuerzas de adsorcin de la superfie externa del gel que luego son excluidas
de la fase estacionaria.
5. Migracin Elctrica: Los componentes inicos de una muestra son
separados por su diferente velocidad y sentido con que se desplazan en
un campo elctrico. La fase estacionaria puede ser un papel saturado por
un electrolito. La aplicacin de un campo provoca un movimiento
diferencial de los iones dependiendo de su carga y de su movilidad ionica.



CLASIFICACION
Existen muchas maneras de clasificar los mtodos cromatogrficos
1. segn su fase mvil se clasifica en:
a) Cromatografa de gases que puede ser a travs de dos sistemas, gas-
lquido y gas-slido
b) Cromatografa lquida donde el eluyente es un lquido y puede ser lquido-
liquido, liquido-slido


CLASIFICACION
2. Por el mecanismo de retencin-separacin, es decir el tipo de equilibrio
implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra;
a) Cromatografa de reparto
b) De adsorcin
c) De exclusin..

CLASIFICACION
3. Segn la forma de contacto entre las fases se denomina:
a) De columna
b) Superficie plana.
4. Tambin se puede clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la
dimensionalidad, escala fsica y gradientes

TERMINOLOGIA

Analito, es la substancia que se va a separar durante la cromatorafa.
Cromatografa analtica, se emplea para determinar la existencia y
posiblemente tambin la concentracin de un analito en una muestra.
Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a
las partculas de soporte o a las paredes internas de la columna.
Cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de
separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla separada.

TERMINOLOGIA
Cromatgrafo es el equipo que permite una separacin sofisticada. Por
ejemplo, un cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de lquidos.
Eluyente es la fase mvil que atraviesa la columna.
Fase mvil, es la fase que se mueve en una direccin definida. Puede ser un
lquido)
Fase inmovilizada es una fase estacionaria que est inmovilizada sobre
partculas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.
Tiempo de retencin es el tiempo caracterstico que tarda un analito
particular en pasar a travs del sistema (desde la columna de entrada hasta
el detector) bajo las condiciones fijadas.
Capilaridad, propiedad de los lquidos de ascender a travs de otro material,
depende de la tensin superficial del mismo
.
TERMINOLOGIA
La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la
posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal,
mide la retencin de un componente.
Se define como: RF= Distancia de la muestra desde el origen/Distancia del
eluyente desde el origen
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el
centro de la mancha
los clculos se simplifican si el denominador es 10.
Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de
condiciones (Espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad
de muestra).
El mximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF
entre 0.55 y 0.7.

CROMAOGRAFIA PLANA
Se realiza sobre papel u otro material slido. Suele llamarse en capa fina
o en capa delgada porque la fase estacionaria recubre un soporte
plano y rgido.

ELECCION DEL ELUYENTE
La eleccin del eluyente depende del componente que se va a separar y del
material en que la separacin se lleva a cabo. Un mtodo que se emplea para
la seleccin del eluyente es una cromatografa en capa fina con distintos
disolventes y unas muestras patrn.
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
ter de petrleo
ter dietlico
Ciclohexano
Acetato de etilo
Tetracloruro de carbono
Piridina
Benceno
Etanol
Cloroformo
Metanol
Diclorometano
Agua
cido actico

ELECCION DEL ELUYENTE
En la eleccin del eluyente influyen varios factores:
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes a menos que se conozcan las
proporciones de los disolventes que conformen la mezcla
(reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy voltiles.
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La eleccin del eluyente se realiza con el anlisis de la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

REVELADORES
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de
dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos:
Mtodos qumicos. Mtodos fsicos.
Mtodos qumicos Consisten en realizar una reaccin qumica entre un reactivo
revelador y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los
reactivos reveladores.
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos
coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las
manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar las
manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con
los componentes orgnicos produciendo manchas negras.
Tambin es utilizado el permanganato potsico, que deja unas manchas de color
amarillo. El tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de
componente separado.
Adems de estos reveladores generales, existen otros especficos:
2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehdos y cetonas). Verde de bromocresol (para
cidos carboxlicos). Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). Ninhidrina
(para aminocidos).

REVELADORES
Mtodos fsicos. El ms comn consiste en aadir al adsorbente un
indicador fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una
lmpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de
onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay
componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente
excepto donde hay componentes.
Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal)
con lo que pueden ser detectados directamente en una lmpara de
ultravioleta.

CROMAOGRAFIA PLANA
R
f
es el factor de retardo o retraso, que mide la movilidad relativa de cada
componente con respecto al mximo posible, la distancia recorrida por el frente
de fase mvil.



Componente 1: R
f
= a / D
Componente 2: R
f
= b / D
Componente 3: R
f
= c / D

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
F.M. lquida, F.E. slida: columnas de varios mm de dimetro y varios cm de
longitud.
F.M. gas, F.E. slida: columnas de unos 5 mm de dimetro y 1-20 m de longitud.
F.M. gas, F.E. lquida: columnas capilares, con menor dimetro y 30-100 m (incluso
ms) de longitud.


Puede verse una animacin del avance de las molculas por la columna.
1. Muestra depositada sobre el lecho
cromatogrfico
2. La muestra penetra en el lecho
3. Se aade fase mvil
4. Comienza la separacin de los
componentes de la muestra
7. Eluye el primer componente
9. Eluye el segundo componente

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Almina (Al2O3), Slica u Oxido de
Magnesio.
La fase estacionaria esta constituida por un slido poroso, el cual queda
soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plstico o
vidrio.
La fase mvil se encuentra formada por la solucin que lentamente va
atravesando la fase estacionaria.
La solucin que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por
nueva solucin que se suministra desde un contenedor por la parte superior de
la columna.
La migracin de las sustancias de la mezcla a travs de la columna se
encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que
cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria.
Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda
total, la separacin, y por tanto la resolucin, aumenta con la longitud de la
columna.
CROMATOGRAFIA DE GASES
Se utiliza para la separacin de sustancias gaseosas.
La Fase Mvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede
ser un slido (Cromatografa Gas-Slido)
O una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin (Generalmente Polietiln-
Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte (Cromatografa Gas-Lquido).
El cromatgrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una
entrada del gas portador, un puerto de inyeccin, una columna normalmente
localizada en el interior de una cmara termostatizada (horno), un detector y un
sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatgrama.
La muestra se introduce a travs del sistema de inyeccin dentro de la
columna que es el sitio donde ocurre la separacin.
CROMATOGRAFIA DE GASES
La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o tefln contiene la fase
estacionaria slida o lquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es
generalmente de slice.
La fase mvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a travs
de la columna, por esta razn debe ser inerte para evitar interacciones con la
muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusin gaseosa.
Al final de la columna existe el detector que permite la deteccin y
cuantificacin de las sustancias, midiendo conductividad trmica y
electronegatividad de las sustancias eludas. Se produce una seal tipo
elctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un
integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los
componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatgrama en
forma de picos y se determinan medidas como la altura y el rea del pico.

CROMATOGRAMA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA
PRESION
Es una Cromatografa de alta presin es decir se aplica el flujo a presin (entre
1500 a 2200 psi).
La fase estacionaria, presenta tamao de partcula es entre 3 y 10 micras,
La longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo
sofisticado.
Se pueden analizar muestras proteicas.
La reduccin del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la
columna, limita el ensanchamiento por difusin de las bandas, aumentando
por tanto la resolucin
El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una
bomba que inyecte el lquido a la columna.
Generalmente las columnas de slica requieren alta presin para que el flujo
de lquido sea adecuado
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
La mezcladora se requiere para variar la proporcin de solvente en la fase
mvil
El inyector permite la aplicacin de la muestra.
A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorcin
ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las molculas que
eluyen de la columna, se requiere un colector.
En los sistemas modernos el anlisis de la informacin obtenida se realizan
mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la
cromatografa, identificar la naturaleza los picos eludos y cuantificar su
contenido.
Los picos se relacionan segn su "tiempo de retencin" con estndares, que
permiten identificar los aminocidos presentes en la mezcla.
La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el rea la
curva del pico correspondiente.

HPLC
CROMATOGRAFIA DE ADSORCION
(atencin: es adsorcin, no absorcin)
Diferente afinidad de adsorcin de los componentes de la muestra sobre
la superficie de un slido activo. La adsorcin es la capacidad de las
superficies para fijar molculas.
La F.E. es siempre slida. Ejemplos: almina, gel de slice, carbn activo,
fosfato clcico, hidroxiapatito...

CROMATOGRAFIA DE REPARTO
Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la fase
estacionaria (caso de la cromatografa de gases), o diferentes
solubilidades de los componentes en las fases mvil y estacionaria (caso
de la cromatografa lquida).
Ejemplos: en cromatografa plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados
a la celulosa (papel) o al soporte slido que forma la capa fina; en
columna, como F.E. se usan tierra de diatomeas, gel de slice, celulosa en
polvo...

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO
IONICO
Diferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la
muestra.
Qu significa intercambio de iones? La F.E. posee carga elctrica y por
ello interacciona con los componentes de la muestra que tienen carga
opuesta.
Intercambio aninico: F.E. con carga positiva, une aniones, bien los del
disolvente (F.M.) o bien los de la muestra (de ah la palabra intercambio).
Intercambio catinico: F.E. con carga negativa, une cationes, bien los del
disolvente (F.M.) o bien los de la muestra.
Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos covalentemente
a la F.E. slida):

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO
IONICO
intercambiadores catinicos intercambiadores aninicos
carboximetilo (CM)
sulfopropilo (SP)
fosforilo
sulfonato
carboxilato
dietilaminoetilo (DEAE)
dietil-(2 hidroxipropil)aminoetilo
polietilenimina
La F.E. suele llamarse resina (de intercambio inico).
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION
Tambin se llama de exclusin molecular.
Estrictamente, se basa en diferencias de tamao, forma o carga entre las
molculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo ms
habitual es aprovechar las diferencias de forma y tamao.
En este caso, se la llama tambin cromatografa de exclusin por tamao,
de filtracin en gel, de permeacin en gel o de tamiz molecular.
Aplicaciones:
Para la purificacin de una protena (al igual que otras tcnicas
cromatogrficas).
Se puede establecer una correlacin entre el tamao molecular y la
movilidad en la columna de exclusin, por lo que esta tcnica se emplea
para determinar masas moleculares.
Para eliminar sustancias de pequeo tamao molecular de una muestra
proteica (p.ej. eliminacin del exceso de reactivos tras tratar una protena
en el laboratorio, eliminacin de inhibidores enzimticos,...). El resultado es
similar a una dilisis, pero ms rpido.