Local do trabalho: Laboratrio de Engenharia Bioqumica
UFCG/CCT/UAEQ Motivao
Objetivos
Reviso bibliogrfica
Materiais e mtodos
Resultados e discusso
Concluses MOTIVAO Processos biotecnolgicos (enzimas): o mercado brasileiro essencialmente importador em termos de produo e uso das enzimas no pas
Pectinases: 25% das vendas globais (alimentcias)
Aplicaes:
amadurecimento de frutas; clarificao e reduo de viscosidade em sucos de frutas; tratamento do suco de uva; extrao de polpa de tomate; tratamento de resduos vegetais; degomagem de fibras (indstria txtil e de papel); extrao de leos vegetais;
Produo: Fermentao (fungos do gnero Aspergillus e Penicillium)
Substrato: resduo do umbu
MOTIVAO Concentrao e purificao: Processos de custo elevado
SABs: Rendimentos elevados em tempos curtos e com custos baixos
Caracterizao das enzimas: Labilidade OBJETIVOS o Objetivo Geral Caracterizar a exo-poligalacturonase, produzida por fermentao semisslida da casca do umbu e concentrada em SABs, quanto a estabilidade frente a variao do pH e temperatura e condies de temperaturas e pHs timos do extrato enzimtico bruto e das fases PEG e sal dos SABs para o substrato utilizado (cido poligalacturnico). OBJETIVOS o Objetivos especficos Caracterizar a farinha da casca do umbu;
produzir a enzima exo-poligalacturonase por meio da fermentao semisslida da casca do umbu;
obter o extrato enzimtico bruto, produzido pela fermentao semisslida;
concentrar as enzimas pectinases em SABs do Tipo PEG- SAL, nas condies operacionais adequadas;
caracterizar os SABs;
caracterizar as enzimas obtidas quanto ao pH timo e temperatura tima no extrato bruto e no SABs;
determinar a estabilidade da enzima no extrato bruto e nos SABs frente a variaes de pH e temperatura.
REVISO BIBLIOGRFICA o Umbu
Tpica da regio semirida do Brasil.
Aproveitamento total da planta.
Produo de 9.268 toneladas (IBGE).
Perodo de safra rpida com abundncia de frutos (28 e 32 mil frutos por planta, algo em torno de 350 quilos safra/ano).
Independente da irregularidade da chuva
Grande perda por falta de infraestrutura e tecnologias de processamento. REVISO BIBLIOGRFICA o Pectina
Polissacardeos constitudo na maioria por cidos D- galacturnicos unidos por ligaes o1,4 no qual, pelo menos 75 % dos grupos carboxila do cido galacturnico so esterificados com metanol.
Confere: rigidez parede celular quando est ligado celulose.
cido galacturnico c. galacturnico metilesterificado Figura 1 - Estrutura da molcula de pectina REVISO BIBLIOGRFICA o Pectina
Ligao 1,4 so hidrolisados em meios cidos originando monossacardeos e em meios bsicos desmetoxilada.
Utilizadas como agentes geleificantes e fibras funcionais.
REVISO BIBLIOGRFICA o Pectinases Enzimas que reconhecem ligaes entre unidades de cidos galacturnicos. Produzidas por vegetais e micro-organismos Utilizadas pelas indstrias de processamento de frutas Constitudas por um complexo multienzimtico. Classificao: Pectinaesterase, Protopectinases, Despolimerizantes (hidrolticas e as liases): catalisam a clivagem das ligaes glicosdicas das substncias pcticas Hidrolticas: poligalacturonases e as polimetilgalacturonases
REVISO BIBLIOGRFICA o Pectinases (POLIGALACTURONASES)
Ativadas em pHs 4,0-6,0 e temperaturas de30-40C.
Endo-PG: hidrolisam as ligaes glicosdicas (14) internas de forma randmica.
Exo-PG: removem as molculas de cido D-galacturnico pela hidrlise das ligaes glicosdicas (14) a partir da extremidade
exo-PG endo-PG Figura 2 - Forma de atuao das exo-PG e endo- PG REVISO BIBLIOGRFICA o Produo de Pectinases (FSS)
Bactrias, fungos e leveduras
Fungos Filamentosos
Mais adaptveis ao meio
Alta atividade
Atividade tima em faixa de pH baixa
Fermentao semi-slida (FSS):
Ausncia de gua livre
Slido natural como substrato ou suporte inerte
Possibilidade de usar resduos agroindustriais (matrias-primas: 60% a 80% do custo final)
Alta produtividade
Alta concentrao dos produtos
Figura 3 - Aspergillus niger REVISO BIBLIOGRFICA o SABs (downstream processing)
No agressivo (65 a 90% gua) Alto grau de purificao e rendimento Processamento contnuo Baixo custo
Composto por polmero de alto peso molecular e soluo concentrada de sal liotrpico ou dois polmeros solveis em gua
As biomolculas tendem a se distribuir entre as fases conforme a afinidade.
Figura 4: SAB REVISO BIBLIOGRFICA o Caracterizao da enzima
Enzimas so protenas eu atuam com catalizadores de reaes bioqumicas
Desnaturao: alterao sensvel na estrutura original da protena
Fatores que causam a desnaturao das protenas:
pH; temperatura; agentes caotrpicos.
Condies industriais
Figura 5 modo de ao enzimtica da PG em uma molcula de pectina REVISO BIBLIOGRFICA o Caracterizao da enzima
Estudo da Arte
Zheng e Shetty (2000)
Efeito do pH e temperatura na estabilidade da PG produzida por Lentinus edodes usando resduos de frutas como substrato. A PG mostrou estabilidade em uma faixa de temperatura de 50C a 85C, apresentando cerca de 90% de atividade e uma faixa de pH de 3,5 a 6,5.
Martins et al. (2005)
Efeito do pH e temperatura na estabilidade da PG produzida por fermentao submersa, utilizando Termoascus aurantiacus. A PG mostrou estabilidade abaixo de 50C, apresentando 80% da atividade e na faixa de pH de 3,0 a 3,5, apresentando 91% de atividade.
MATERIAIS E MTODOS o Matria-Prima Casca do umbu (Spondias tuberosa). Figura 6 Cascas do umbu MATERIAIS E MTODOS o Preparao da Farinha da Casca do Umbu (Resduo Seco)
Aquisio dos umbus Higienizao Descascamento Secagem Moagem MATERIAIS E MTODOS o Caracterizao Fsico-Qumica do Resduo Seco Granulometria Densidade aparente ( a ) Densidade real ( r ) Porosidade pH Teor de umidade Cinzas Slidos solveis totais (Brix) Acares redutores Acares totais Pectina Protena Bruta
MATERIAIS E MTODOS o Processo fermentativo Preparao do substrato Esterilizao Inoculao Incubao Extrao MATERIAIS E MTODOS o Preparao do substrato Fonte de Nitrognio: 1,5% (NH 4 ) 2 SO 4 Umidade: 60% o Esterilizao Presso: 1 atm
Tempo: 15 min o Inoculao Inculo: 10 7 esporos/g de meio o Incubao Tempo: 44 horas Temperatura: 30 o C MATERIAIS E MTODOS o Extrao Solvente: tampo acetato de sdio 200 mM, pH 4,5 / gua Razo solvente/massa: 10ml/g de amostra Tempo: 45 min Temperatura: 30 o C Agitao: 150rpm
MATERIAIS E MTODOS o Atividade exo-poligalacturonase nas condies padro Extrato Enzimtico Soluo de cido Poligalacturnico (0,25% m/v) Absorbncia DNS 35C 30min pH4,5 Banho maria por 5 min MATERIAIS E MTODOS o Atividade exo-poligalacturonase nas condies padro Procedimento: COURI (1993), seguindo a adaptao da Embrapa Agroindstria Tropical Fortaleza/CE.
( ) .17.2. 212,16. a b meiofermentado Abs Abs f U APG RE g t | |
= | | \ . MATERIAIS E MTODOS o Recuperao e concentrao da exo-pg utilizando SABs Preparao do SAB (PEG 8000/fosfato de potssio)
72% de extrato enzimtico 12% de fosfato de potssio 16% de PEG
Coleta das fases PEG SAL MATERIAIS E MTODOS o Recuperao e concentrao da exo-pg utilizando SABs Caracterizao das fases Volume Densidade Massa Atividade Enzimtica Teor de Protena MATERIAIS E MTODOS o Recuperao e concentrao da exo-pg utilizando SABs Determinao dos coeficientes de partio (Kp e Ke).
Avaliao do processo de concentrao da exo- poligalacturonase. MATERIAIS E MTODOS o Caracterizao da Exo-poligalacturonase Estabilidade Frente a temperatura (30-90C) Estabilidade Frente ao pH (2,5-9,8) Temperatura tima (30-90C) pH timo (2,5-9,8) R R P A AT A = RESULTADOS E DISCUSSO Parmetros analisados Valor Umidade b.s. (%) 8,47 0,10 Cinzas (%) 3,93 0,08 Protena total (%) 1,81 0,04 Pectina (%) 14,95 1,20 Acares Totais (%) 9,16 0,54 Acares Redutores (%) 8,85 0,08 Slidos solveis totais (Brix) 36,00 0,00 pH 1,84 0,04 Densidade aparente (a)(g/mL) 0,53 0,01 Densidade real (r)(g/mL) 1,57 0,00 Porosidade do leito 0,66 o Caracterizao fsico-qumica dos resduos secos Tabela 1 - Valores mdios e desvios padro dos parmetros fsico- qumicos do resduo seco da casca do umbu. RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao fsico-qumica dos resduos secos Figura 7 - Distribuio granulomtrica do resduo seco da casca do umbu RESULTADOS E DISCUSSO Figura 2 - Recuperao da exo-poligalacturonase nas fases PEG e sal dos SABs
Recuperao da enzima SABs com extrato bruto lixiviado com tampo acetato SABs com extrato bruto lixiviado com gua Rs (%) 39,86 38,14 Ri (%) 70,57 72,05 o Recuperao e concentrao da exo-poligalacturonase SAB contendo o extrato enzimtico lixiviado com tampo acetato:
Ke = 0,53
SAB contendo o extrato enzimtico lixiviado com gua:
Ke = 0,49 RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no extrato enzimtico bruto Figura 8 - Efeito da temperatura na atividade da exo-PG produzida por FSS. Temperatura tima RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no extrato enzimtico bruto Figura 9 - Termoestabilidade da exo-PG produzida por FSS. Estabilidade Frente a temperatura RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no extrato enzimtico bruto Figura 10 - Efeito do pH na atividade da exo-PG produzida por FSS. pH timo RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no extrato enzimtico bruto Figura 11 Estabilidade da exo-PG produzida por FSS frente ao pH. Estabilidade Frente ao pH RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB Figura 12 - Efeito da temperatura na atividade da exo-PG concentrada na fase PEG. Temperatura tima da exo-PG na fase PEG RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB Figura 13 - Estabilidade da exo-PG concentrada na fase PEG frente a temperatura. Estabilidade da exo-PG concentrada na fase PEG frente a temperatura RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB Figura 14 - Efeito da temperatura na atividade da exo-PG concentrada na fase sal. Temperatura tima da exo-PG na fase sal RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB Figura 15 - Estabilidade da exo-PG concentrada na fase sal frente a temperatura. Estabilidade da exo-PG concentrada na fase sal frente a temperatura RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB Figura 16 Efeito do pH na atividade da exo-PG concentrada na fase PEG. pH timo da exo-PG na fase PEG RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB Figura 17 - Estabilidade da exo-PG concentrada na fase PEG frente ao pH. Estabilidade da exo-PG concentrada na fase PEG frente ao pH RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB Figura 18 Efeito do pH na atividade da exo-PG concentrada na fase sal. pH timo da exo-PG na fase sal RESULTADOS E DISCUSSO o Caracterizao da exo-poligalacturonase no SAB Figura 19 - Estabilidade da exo-PG concentrada na fase sal frente ao pH. Estabilidade da exo-PG concentrada na fase sal frente ao pH CONCLUSES O Resduo da casca do umbu promissor para obteno de poligalacturonases.
A estabilidade da exo-PG no extrato enzimtico bruto na faixa de (30 a 60C) com mxima atividade residual de 83% na temperatura de 30C.
A estabilidade da exo-PG no extrato enzimtico bruto na faixa de pH cido (2,5-5,6) com atividades residuais em torno de 90%.
A temperatura tima foi da exo-PG no extrato enzimtico bruto foi a 40C, apresentando 100% da atividade residual
O pH timo foi da exo-PG no extrato enzimtico bruto foi 2,5, apresentando 60% da atividade residual.
A expo-PG presente no extrato enzimtico bruto apresentou uma partio em torno de 70% para a fase inferior, rica em sal.
. CONCLUSES A estabilidade da exo-PG concentrada na fase PEG apresentou os melhores resultados na faixa de (30-50C), sendo a mxima atividade residual encontrada (85,3%) na temperatura de 50C.
A estabilidade da exo-PG concentrada na fase Sal apresentou os melhores resultados na faixa de (30-60C), sendo a mxima atividade residual (60%) obtida nas temperaturas de 40C e 60C.
A estabilidade frente as variaes de pH da exo-PG concentrada na fase PEG apresentou os melhores resultados na faixa de pH cido (2,5-5,6), sendo a melhor atividade residual (81%) obtida no pH 2,5.
A estabilidade frente as variaes de pH na fase sal apresentou os melhores resultados na faixa de pH (3,5-7,5) com valores em torno de 92,42%.
CONCLUSES A temperatura tima da exo-PG na fase PEG foi de 30C e 40C e o pH timo foi 5,6, apresentando atividade residual de 36% e 56% respectivamente.
A temperatura tima da exo-PG na fase sal foi de 30C e o pH 3,6, apresentando atividade residual de 79% e 85% respectivamente.
A exo-poligalacturonase produzidade por o Aspergillus niger CCT 0916 uma enzima mesoflica e cida.
Aps ser concentrada em SABs, a exo-poligalacturonase apresenta uma maior resistncia trmica, passando a tolerar temperaturas levemente mais altas.