Cuantificacion de

proteinas
MARTINEZ GONZALEZ GUSTAVO ARMANDO
RODRIGUEZ TREJO JUAN GUILLERMO


Mtodos para la cuantificacin de
protenas:


Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de
estos mtodos se basan en:

a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV,
b) para la formacin de derivados qumicos
c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes.

Metodos de cuantificacion
Mtodos de Absorcin:
Propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV.

Mtodos Derivados Fluorimtricos:
Formacin de derivados qumicos.

Mtodos Colorimtricos
La capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes
Metodo UV
Todas la protenas pueden ser detectadas, sin embargo solo ciertos residuos de
aminocidos son los que se leen en la regin del UV.

Absorcion UV en proteinas
Las bandas de absorcin ms significativas se encuentra en el ultravioleta cercano,
en el intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm.

Concretamente absorben en este rango las cadenas laterales de los aminocidos
aromticos, la histidina y la cistina.

Ley lambert
Relaciona la absorcin de luz con las propiedades del material atravesado.
La ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs
de una sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la
transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa.
Si conocemos l y A, la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de
la cantidad de luz transmitida.

METODOS
COLORIMETRICOS
Mtodo de Biuret
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu
2+
y los grupos
NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu
2+
se acompleja con 4 NH.
La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de
protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera
que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y
slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy
concentrados (por ejemplo en suero).
Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO
4
.5H
2
O y 6,7 g
NaEDTA en 700 ml de H
2
O. Mientras se agita aadir 200 ml de NaOH 5N y luego
1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de plstico.

Mtodo de Bradford
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva
Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas
una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un
complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el
colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y
pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que
interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.
Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie Blue G-
250 con 10 ml de fosfrico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto. Aadir H
2
O
hasta 100 ml. Filtrar a travs de papel de filtro y guardar en la oscuridad.

Mtodo de BCA
El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un
complejo prpura intenso con inones Cu
1+
en medio alcalino. Este reactivo
forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso
producido en una reaccin entre las protenas con Cu
2+
en medio alcalino
(reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona
un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy
sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros
mtodos.
Reactivo preparado del siguiente modo.
Reactivo A: BCA 1%, Na
2
CO
3
2%, tartrato sdico 0,16%, NaOH 0,4% y NaHCO
3
0,95%. Ajustar a pH 11,25 con NaOH.
Reactivo B: CuSO
4
al 4%
Reactivo de trabajo: mezclar 100 volmenes de A con 2 volmenes de B.

METODO DE LOWRY
Este procedimiento involucra la formacin de un compejo cobre - protena en
solucin alcalina.

Este complejo reduce al reactivo fosfomolibdico- fosfotungstato lo que produce
una intensa coloracin azul.

Primera reaccin Biuret. Los iones Cu2+, en medio
alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno
de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul
claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la
protena, exponindose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda
etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su
complejo con tartrato.

Segunda reaccin reactivo de Folin- Ciocalteau. La reduccin, tambin en
medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenlicos de los
residuos de tirosina presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre
como catalizador.
El reactivo de Folin-Ciocalteau es una mezcla de fosfomolibdato y
fosfotungstato, usado para la determinacin de antioxidantes
fenlicos y polifenlicos de color amarillo, que al ser reducido por los
grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.
Sin embargo, este reactivo no slo mide los fenoles totales, sino que reaccionar
con cualquier sustancia reductora.


Metodos fluorimetricos
En el fenmeno de la fluorescencia, una molcula emite luz de una longitud de
onda determinada tras absorber luz a otra longitud de onda.
Los ensayos fluorimtricos usan la diferencia en la fluorescencia entre producto y
sustrato para medir la reaccin enzimtica.

Tcnicas de separacin y anlisis de las
protenas
Los procedimientos ms utilizados actualmente en el laboratorio clnico para
el estudio de las protenas son los siguientes:
1. Turbidimetra y nefelometra
2. Inmunodifusin
3. Electroforesis
4. Inmunoelectroforesis
5. Inmunoelectroforesis en cohete
6. Inmunofijacin
7. Cromatografa
TURBIDIMETRA Y NEFELOMETRA
La dispersin de la luz se puede medir por turbidimetra o por nefelometra.
En ambas tcnicas, para dar como resultado una concentracin de protena
concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de
dispersin con los valores de dichos parmetros en estndares proteicos
conocidos.
La turbidimetra mide la disminucin de la luz transmitida a travs de una suspensin de
partculas utilizando para ello un espectrofotmetro (detector en la misma direccin del haz de
luz, se mide A o T).
La nefelometra: mide la luz dispersada en direccin distinta a la luz
emitida (generalmente con ngulos que oscilan entre 15 y 90).
Utiliza como instrumento el nefelmetro (en el que el detector se
ubica con un ngulo que oscila entre 15 y 90 ej. a 90). Se suele
utilizar para concentraciones ms diluidas.
INMUNODIFUSIN
La inmunodifusin se basa en la formacin de bandas de precipitacin Ag-Ac
en medios semislidos (generalmente de agarosa).
La zona ptima de concentracin para la formacin del precipitado Ag-Ac se
llama zona de equivalencia.
Para visualizar el resultado de la inmunodifusin, una vez terminada la
difusin se lava el gel y se tie con colorantes para protenas (ej. Negro
amido o azul brillante de Coomassie).
Inconvenientes de la inmunodifusin:
1. Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo contrario no se alcanza
la equivalencia y no se forma el precipitado. El precipitado solo se forma en el punto de
equivalencia o cuando hay un ligero exceso de Ag.
2. Las molculas ms pequeas migran con ms rapidez que las de gran tamao y conforme la
migracin contina el precipitado puede redisolverse y volverse a formar de acuerdo con los
cambios de concentracin de Ag o Ac en el gel.
3. Si hay grandes cantidades de Ac, el antgeno no se difunde muy lejos antes de alcanzar la
equivalencia y el anillo es ms grueso o espeso.
ELECTROFORESIS
Una de las tcnicas ms sencillas para la separacin (y posterior
cuantificacin) de protenas es la electroforesis (tcnica en la cual una
partcula cargada se hace desplazar a travs de un medio aplicando un campo
elctrico).
Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de protenas puesto
que los aminocidos (aa) constituyentes de la protenas, y por tanto las
protenas, son compuestos anfteros que se comportan como cidos (ceden
protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones y quedan con
carga positiva) dependiendo del medio en el que estn.
Si una disolucin de protenas se somete a la accin de un campo elctrico la tasa de migracin
durante la electroforesis depende de:
La carga neta de la molcula, su forma y tamao
La fuerza del campo elctrico
Caractersticas del soporte

La cantidad de carga neta en la molcula es variable y depende del pH del amortiguador. Si el
pH del medio es menor que el punto isoelctrico, las protenas se comportan como cationes y, si
el pH del medio es superior al pI, se comportan como aniones.
La carga de la protena se hace ms negativa a medida que el pH del amortiguador se hace ms
bsico.
A pH 8,6 (bsico) todas las protenas migran hacia el nodo (tienen carga global negativa). La
albmina, con pI de 4,7 tendr una mayor carga negativa que la gamma-globulina, que tiene un
pI de 7,2.
En definitiva, lo anterior explica que la albmina recorra una mayor distancia que la gamma-
globulina cuando se siten en un campo elctrico.
Los pasos a seguir en una electroforesis se pueden resumir en:

1. Separacin
2. Fijacin
3. Revelado
4. Cuantificacin

INMUNOELECTROFORESIS
La inmunoelectroforesis es una inmunodifusin en la que se aplica una
corriente elctrica para separar las protenas de la muestra.
Esta tcnica se realiza en dos fases:
Electroforesis para separar las protenas de la muestra en funcin de su
carga.
Aplicacin de un antisuero, mono o poliespecfico, en un surco paralelo a la
direccin del campo elctrico. El o los anticuerpos difunden durante 18-24h.
Si se produce el reconocimiento Ag-Ac se forman bandas de precipitacin.
INMUNOELECTROFORESIS EN COHETE
La inmunoelectroforesis en cohete es una tcnica cuantitativa equivalente a
la inmunodifusin radial pero, a en la que la placa se expone a un campo
elctrico.
INMUNOFIJACIN
La inmunofijacin consiste en la separacin electrofortica de las protenas
de una muestra seguida del contacto del gel con una tira de acetato de
celulosa impregnada con antisuero.

La unin Ag-Ac da lugar a la formacin de bandas de precipitacin
visulalizadas tras lavar y teir. Es una tcnica muy rpida que se utiliza
especialmente en le deteccin de bandas oligoclonales en lquido
cefalorraqudeo.
bibliografia
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20D
E%20PROTE%C3%8DNAS.pdf
Manual de Practicas Biologia Molecular de la Celula L
Escrito por Claudia Andrea Segal Kischinevzky,Universidad Nacional Autnoma
de Mxico. Facultad de Ciencias
Aspectos bsicos de bioqumica clnica
Escrito por Jacobo Daz Portillo,Mara Teresa Fernndez del Barrio,Fernando
Paredes Salido