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MEDICINA DI

LABORATORIO
BIOCHIMICA CLINICA
• è una scienza clinica applicata
• che studia le alterazioni
dell’organismo nello stato di malattia

• con metodi chimici, fisici e biologici


• Cellule/strutture dell’organismo
Equilibrio dinamico chimico-fisico
=
Equilibrio omeostatico
• sotto controllo
sist. neurovegetativo/endocrino/enzimatico
caratteri fisiologici
• Insulto di varia natura
alterazione omeostasi
Comparsa di caratteri patologici
Conoscendo l’ambito di normalità di ogni
componente dell’organismo nei vari
materiali biologici, ogni fluttuazione da
questo ambito sarebbe da correlare con
un’alterazione funzionale di un organo o
tessuto.
Interpretazione clinica-interpretazione
statistica
La Biochimica Clinica studia l’effetto della
malattia sui processi biochimici di organi,
tessuti, liquidi biologici
OGGETTO degli esami di lab.
=
liquidi o tessuti umani
Caratteristica: facile disponibilità
La Biochimica Clinica studia l’effetto della
malattia sui processi biochimici di organi,
tessuti, liquidi biologici
OGGETTO degli esami di lab.
=
liquidi o tessuti umani
Caratteristica: facile disponibilità
• Sangue e derivati:
– Sangue intero
– Plasma (sangue reso incoagulabile e privato degli elementi
corpuscolati)
– Siero (frazione liquida di derivazione ematica priva delle
cellule, del fibrinogeno e di diversi fattori della
coagulazione) =frazione liquida dopo coagulazione
• Urine
• Liquido cefalo-rachidiano
• Liquido sinoviale
• Liquidi di versamento delle cavità sierose (pleurica,
pericardica, peritoneale)
• Liquido amniotico
• Liquido seminale
• Succo gastrico
• Feci
ESAMI DI LABORATORIO

EVIDENZIARE LA PRESENZA E MISURARE LA


QUANTITA’ DI UN COSTITUENTE IN

CAMPIONI BIOLOGICI

dosaggio di ANALITI

DATI
NUMERICI
Scopi specifici dei tests di
laboratorio
• Screening (medicina preventiva)
• Diagnosi
• Valutazione della gravità della malattia
(prognosi)
• Monitoraggio dell’evoluzione della malattia
(follow-up) e della risposta alla terapia
• ricerca
Contributo degli esami di
laboratorio nella diagnosi di una
malattia
Soggetto malato Soggetto
apparentemente
sano
Anamnesi 55% 35%
Esame 20% 5%
obiettivo
Indagini di 20% 45%
laboratorio
Screening
Presupposto: un adeguato trattamento nella
fase subclinica può essere di maggior beneficio
per il paziente. Generalmente su gruppi
selezionati di popolazione che abbiano in
comune una caratteristica .La strategia di
scelta dipende dal rischio che la condizione
rappresenta, dalla probabilità della sua
esistenza, dalla disponibilità di tests di
screening adeguati e dai costi. Possono essere
condotti in età prenatale, infantile o adulta
Richiesta del test-
Motivi
• A favore della collettività
– Prevenzione
– Ricerca epidemiologica
– Politica sanitaria
– Ricerca bio-medica
Intervallo di riferimento
L’OMEOSTASI dell’organismo fa sì che la
concentrazione dei componenti del
sistema (parametri biochimici) sia
costantemente mantenuta entro
determinati limiti:
tali limiti rappresentano l’ambito della
cosiddetta “NORMALITÀ”
Intervallo di riferimento
• comprende i VALORI DI CONCENTRAZIONE
più FREQUENTEMENTE RISCONTRATI
NEGLI INDIVIDUI SANI
• Intervallo (range) entro il quale sono attesi i
valori per il parametro analizzato
• Ma viene stabilito con criteri ARBITRARI:
Intervallo di riferimento
• Selezione della popolazione di riferimento
• Selezione del campione di riferimento
– Stato apparente di salute
– Campione rappresentativo della popolazione
• Dosaggio dell’analita su tutti i componenti
del campione
• Costruzione della curva
• Es: distribuzione della concentrazione delle
proteine plasmatiche osservata in un gruppo
di studenti sani
Distribuzione delle proteine
plasmatiche totali
35

30
Numero di studenti

25

20

15

10

0
5,8 6 6,4 6,6 6,8 7 7,2 7,4 7,6 7,8 8 8,2 8,4
Proteine totali (g/dl)
Intervallo di riferimento
Strategie nella richiesta di
esami di laboratorio
• Raggruppamenti di esami con validità diagnostica
generale ipotetica o provata dall’esperienza
(raggruppamenti storici)
• Profili biochimici (analiti correlati fra loro, validità
diagnostica generale)
• Raggruppamenti di esami mirati a convalidare un
sospetto diagnostico basati su Protocolli
diagnostici a più stadi o livelli: schema di
richieste a cascata, in base ai risultati.
• Esami di screening
• Esami di urgenza
LA VARIABILITA’

Per poter attribuire una reale validità


diagnostica a differenze tra valori cui si
attribuisce significato patologico e i valori di
riferimento, bisogna ridurre al minimo le
cause di variabilità
VARIABILITA’ PRE-
ANALITICA
FATTORI PREANALITICI
•Fattori TECNICI
•Fattori BIOLOGICI
Fattori TECNICI CAMPIONE DI
SANGUE RAPPRESENTATIVO
•corretta identificazione del paziente
•appropriata preparazione del paziente
•corretta raccolta del campione
•etichettatura
•trasporto del campione al laboratorio
•conservazione
VARIABILITA’ BIOLOGICA
Alcuni fattori biologici che influiscono sui parametri ematochimici
Variabilità inter-individuale
• Età
• Sesso
• Gravidanza
• Dieta
• Ambiente
• Geografia/etnia
• Tipo di lavoro
• postura
Variabilità intra-individuale
• Ritmi circadiani/stagionali
• Ciclo mestruale
• Affaticamento
• Ansia
• Fumo
• Veglia
• Alcool
• farmaci
Analiti dopo esercizio fisico intenso
rispetto alle condizioni di riposo
Appropriata preparazione
del paziente

• Digiuno
• Riposo
• Postura
• Farmaci
• Ritmi circadiani
• Stress…
>
>
>
<

>
Medie ( ) e ambito di variazione per ciascun
soggetto e intervallo di riferimento
SODIO
intraindividuali>
interindividuali

Fosfatasi alcalina
intraindividuali<
interindividuali
VARIABILITA’ ANALITICA
Traguardi analitici
• La variabilità analitica influenza maggiormente (è più
grave) quando la variabilità biologica è bassa
QUINDI
• la % di errore ammessa è diversa per i diversi parametri

• in generale Va < ½ Vbi


CVa = variabilità analitica
CVbi= variabilità biologica
intraindividuale
DIFFERENZA CRITICA
• Quanto nel valore di un risultato, è frutto
della variabilità e quanto del processo
patologico?
• massima differenza imputabile all’effetto
combinato di CVa + CVbi, ad un livello di
probabilità prescelto (0,95)

• Diff. cr. = 2,77 x CV totale

(CVa) 2 + (CVb) 2
• CV tot =
• CV tot ≅ 1,12 x CVb (se CV a < ½ CV b)
Effetto della variabilità biologica sulla
DIFFERENZA CRITICA (con Va 3%)

Vb % Vt % Dcr % Concentrazione di
colesterolo
Iniziale Differenziabile
mg/dl mg/dl
1 2,5 3,9 10,8 275 245
2 5 5,8 16,1 275 231
3 7,5 8,1 22,4 275 213
4 10 10,4 28,8 275 196
5 12,5 12,8 35,4 275 178
FASE
POST- ANALITICA

Refertazione
Modalità di stesura del referto
Sistema (Nome, cognome,
Sotto-sistema (tipo di provenienza, età, sesso)
materiale biologico)

Unità di misura
componente

Valore numerico Intervallo di


del dato di lab
riferimento
FASE
POST- ANALITICA

Interpretazione
TERMINI DI CONFRONTO
L’utilizzo clinico di un risultato analitico ottenuto
in un individuo prevede il confronto con:
l

• Valori osservati in altri individui


– INTERVALLO DI RIFERIMENTO
• Valori fissi, stabiliti in precedenza
– VALORI SOGLIA, valori decisionali
• Valori precedentemente osservati nello
stesso individuo
– DIFFERENZA CRITICA
Livelli decisionali per la calcemia
Valori delle differenze critiche per
alcuni analiti

Le DC sono
state calcolate
nell’assunzione
che la Va dei
metodi impiegati
fosse pari al
traguardo
analitico
Cut Off BASSO
(alta sens.
bassa spec.)
Es:-Test di screening
per patologie curabili
-Test per ricerca
virus in sangue per
trasfusioni

Cut Off ALTO


(alta spec.
bassa sens.)
Es:test di screening
per malattie gravi
incurabili
-Test per selezione
campione da sot-
toporre a terapie
sperimentali
Ruolo del laboratorio
PROTOCOLLI DIAGNOSTICI
Il ruolo del laboratorio è indirizzato da un lato ad evidenziare l’effetto della malattia sul
metabolismo osseo, dall’altro ad evidenziare se alla base esista una patologia
degli ormoni che possono influire sul metabolismo fosfocalcico

DOSAGGI VOLTI A VALUTARE L’ENTITA’ DEL RIMANEGGIAMENTO OSSEO

Calcio e fosforo nel siero e nelle urine (negli individui sani ben correlato con Calcio)
Calcio ionizzato ( senza stasi venosa che aumenta la proteinemia, quindi aumenta il Calcio
totale e diminuisce il pH con aumento del Ca++ ionizzato)
Markers di attività osteoblastica
Markers di riassorbimento osseo

DOSAGGI VOLTI A VALUTARE LA CAUSA PRIMA DEL RIMANEGGIAMENTO

PTH-COOH
PTH-NH2
PTH-MM
PTH totale
Calcitonina
25-OH-VitD
1,25-OH-VitD
Altri ormoni coinvolti nel metabolismo del calcio
Ruolo del laboratorio: quali marcatori?
Caratteristiche dei marcatori di riassorbimento
osseo
Fosfatasi acida tartrato resistente: poco valido
analiticamente e dal punto di vista diagnostico
Idrossiprolina : influenzata da dieta,, deriva anche
dalla sintesi, solo il 10% viene escreto
Galattosilidrossilisina: aminoacido presente
prevalentemente nel collagene osseo. L’escrezione
aumenta soprattutto per perdita di osso trabecolare
Deossipiridinoline: cross-link del collagene osseo
(legami crociati intermolecolari che stabilizzano la
matrice extracellulare): si liberano solo dalla
demolizione in quanto presenti solo nel collagene
maturo
N-Tx(N-telopeptide) e cross-laps: frammenti peptidici
specifici per il collagene osseo
Caratteristiche dei marcatori di
riassorbimento osseo (specificità)
Caratteristiche dei marcatori di
neoformazione ossea

Osteocalcina: lega il calcio mediante tre residui di


acido gammacarbossiglutammico
Fosfatasi alcalina: prodotta dagli osteoblasti
Osteonectina: si lega all’idrossiapatite e al collagene
accelerando la precipitazione del calcio
Propeptidi del procollagene: per una molecola di
collagene che si deposita una molecola di
propeptidi si libera
Marcatori biochimici di
rimodellamento osseo
Vantaggi
• Metodi non invasivi
• Facile da ripetere (riproducibilità)
• Combinazione di vari marcatori
– Accoppiamento tra formazione/riassorbimento
– Di attività cellulare e di costituenti della matrice
• Combinazione con mineralometria ossea
• Grandi variazioni in menopausa e durante
malattie ossee
Marcatori biochimici di
rimodellamento osseo
Limitazioni
• Tecniche (dosaggio)
– Stabilità durante la conservazione
– Precisione, accuratezza del dosaggio
– Sensibilità (basso turnover)
– Specificità (RIA)
– Recupero (HPLC, manca lo std interno)
• Variazioni diurne (tempo di campionamento)
• Parametri non conosciuti: distribuzione in diversi
distretti ossei, metabolismo, clearance
Marcatori biochimici di rimodellamento
osseo: procedure di standardizzazione
Ritmo circadiano di escrezione

Soprattutto
marcatori di
riassorbimento
Ruolo dei marcatori biochimici di
metabolismo osseo
Riflettere la dinamica del ricambio scheletrico
– Prevedere la perdita ossea
– Stimare il rischio di frattura
– Valutare la risposta terapeutica

 Un singolo dato non fornisce informazioni complete


 La valutazione di dati consecutivi ripetuti nel tempo
può fornire informazioni clinicamente utili

Differenza Critica
In conclusione…
Monitoraggio delle affezioni muscolari:
Creatina chinasi (CK MM)
Aldolasi enzima della glicolisi
aumentano durante intenso lavoro muscolare e nella Distrofia
Muscolare (m. di Duchenne) per aumento della permeabilità della
membrana
Mioglobina: proteina caratteristica del muscolo scheletrico: aumenta
in tutte le condizioni morbose riguardanti i muscoli (anche nelle urine)
Troponina: complesso proteico dell’apparato fibrillare
Triade dell’Emostasi

Vaso Piastrine

Coagulazione
Funzioni del Vaso

• Mantenere il sangue nel letto vascolare


• Fornire una superficie non
trombogenica che consenta al sangue
di restare fluido.
• Partecipare attivamente ai processi di
arresto del sanguinamento in caso di
lesione, localizzando l’emostasi.
Funzione delle Piastrine (1)
• Le piastrine aderiscono alla matrice
sottoendoteliale mediante il fattore
Willebrand
• Cambiano di forma
• Secernono sostanze pro-aggreganti
• Aggregano fra di loro
Funzione delle Piastrine (2)

• Le piastrine attivate fungono da


superfice per l’interazione ottimale dei
fattori della coagulazione
• La forza contrattile operata dagli
pseudopodi delle piastrine attivate,
produce la retrazione del coagulo
Funzioni della Coagulazione

• Arrestare l’emorragia mediante la


conversione del Fibrinogeno (soluble) in
Fibrina (insolubile)
Fattori della Coagulazione e Loro
Sinonimi (1)
• Fattore I • Fibrinogeno
• Fattore II • Protrombina
• Fattore III • Tromboplastina tissutale
• Fattore IV • Ioni Calcio
• Fattore V • Proaccelerina
• Fattore VI • Sconosciuto
• Fattore VII • Proconvertina
Fattori della Coagulazione e Loro
Sinonimi (2)
• Fattore VIII • Fattore antiemofilico
• Fattore IX • Fattore Christmas
• Fattore X • Stuart-Prower
• Fattore XI • Antecedente tromboplastina
• Fattore XII • Fattore Hageman
• Fattore XIII • Fibrinoligasi
• Pre-Callicreina • Fattore Fletcher
• Chininogeno alto PM • Fattore Fitzgerald
• Fattore Willebrand
TF -
VIIa
X
TF -
VIIa
Xa
X
TF trauma
Xa VIIa

Prothrombin Thrombin
X
TF -
VIIa
Xa
Ca++
PF3
Prothrombin Thrombin
X
TF -
VIIa
Xa
Ca++
PF3 Va V
Prothrombin Thrombin
X
TF -
VIIa
Xa
Ca+
+PF Va V
3

Prothrombin Thrombin

Fibrinogen Fibrin(s)
X
TF -
VIIa XIII
Xa
Ca+
+PF Va V
3

Prothrombin Thrombin
XIIIa

Fibrinogen Fibrin(s) Fibrin(i


)
IXa IX

TF - XIII
Xa VIIa
Ca+
+PF Va V
3

Prothrombin Thrombin
XIIIa

Fibrinogen Fibrin(s) Fibrin(i


)
IXa IX

TF - XIII
Xa VIIa
Ca+
+PF Va V
3

Prothrombin Thrombin
XIIIa

Fibrinogen Fibrin(s) Fibrin(i


)
IXa IX

Ca++
PF3 X

TF - XIII
Xa VIIa
Ca+
+PF Va V
3

Prothrombin Thrombin
XIIIa

Fibrinogen Fibrin(s) Fibrin(i


)
IXa IX

Ca++ VIIIa VIII


PF3 X

TF - XIII
Xa VIIa
Ca+
+PF Va V
3

Prothrombin Thrombin
XIIIa

Fibrinogen Fibrin(s) Fibrin(i


)
XIa XI

IXa IX

Ca++ VIIIa VIII


PF3 X

TF - XIII
Xa VIIa
Ca+
+PF Va V
3

Prothrombin Thrombin
XIIIa

Fibrinogen Fibrin(s) Fibrin(i)


XIa XI

IXa IX Platelets

Ca++ VIIIa VIII


PF3 X

TF - XIII
Xa VIIa
Ca+
+PF Va V
3

Prothrombin Thrombin
XIIIa

Fibrinogen Fibrin(s) Fibrin(i


)
Pre-Kal Kal Danno endoteliale
XIIa Surface
FXII
XIa XI HMWK

IXa IX

Ca++ VIIIa VIII


PF3 X

TF - XIII
Xa VIIa
Ca+
+PF Va V
3

Prothrombin Thrombin
XIIIa

Fibrinogen Fibrin(s) Fibrin(i


Pre-Kal Kal
Surface
XIIa FXII
HMWK
XIa XI

IXa IX

Ca++ VIIIa VIII


PF3 X

TF - XIII
Xa VIIa
Ca+
+PF Va V
3

Prothrombin Thrombin
XIIIa

Fibrinogen Fibrin(s) Fibrin(i


Attività Anticoagulanti Naturali
Plasmatiche
• Antitrombina
- Inibisce FXa, trombina ed altri
• Proteina C/S
- Inibisce FVa e FVIIIa
• Cofattore Eparinico II
- Inibisce la trombina
• TFPI
- Inibisce il complesso TF-VIIa, FXa
Ex
ic pa trins
r in s ay thw ic
Int thw ay
pa

HMWK
Prekallikrein
Factor XII Fattore Tissuatle
Factor XI Factor VII
Factor IX
Factor VIII

Common
pathway

Factor X
Factor V
Factor II
Factor I

Fibrin
(urea soluble)
+
Factor XIII
Factor XIII
measurement

Fibrin
(cross linked)
Esiti di una Emostasi Alterata
• Emorragia
− Difetto (piastrine e/o fattori della
coagulazione)
• Trombosi
− Eccesso (piastrine e/o fattori della
coagulazione e difetti degli
anticoagulanti naturali)
Emorragia
• Da difetto congenito
− Piastrine
− Fattori della coagulazione
• Da difetto acquisito
− Coagulopatia da consumo
− Epatopatie
− Farmaci antipiastrinici
− Farmaci anticoagulanti
Trombosi
• Occlusione Arteriosa
− Infarto del miocardio
− Ictus
− Trombosi arteriosa periferica
• Occlusione Venosa
− Trombosi venosa profonda (arti inferiori)
− Embolia polmonare
− Trombosi venosa cerebrale
− Trombosi viscerale
− Tromboflebite superficiale
Cosa fare prima di eseguire un
intervento potenzialmente
emorragizzante
• Raccogliere la storia clinica
− Storia emorragica personale
− Storia emorragica famigliare
− Farmaci
− Malattie
• Eseguire uno studio di laboratorio
Principali Test di Laboratorio
per lo Studio dell’Emostasi
Tempo di emorragia
• Si esegue sulla cute dell’avambraccio del
paziente ed esplora la funzionalità della
fase vaso-piastrinica dell’emostasi. E’
prolungato in seguito a:
− Difetto funzionale delle piastrine
− Malattia di von Willebrand
− Aspirina
Tempo di Protrombina
(PT)
Definizione
• Tempo di coagulazione (secondi) a 37°C di una
miscela composta da:
- Plasma citratato
- Tromboplastina
- Calcio cloruro
• Si rileva con:
- Coagulometro
Cause di Prolungamento del
PT
• Carenze congenite dei fattori VII, X, V,
II o fibrinogeno
• Carenze acquisite di uno o più fattori di
cui sopra a seguito di:
− Coagulopatia da consumo
− Epatopatie
− Assunzione di anticoagulanti orali
Tempo di Tromboplastina Parziale Attivato
(APTT)
Definizione
• Tempo di coagulazione (secondi) a
37°C di una miscela composta da:
- Plasma citratato
- Attivatore-Fosfolipidi
- Calcio cloruro
• Si rileva con:
- Coagulometro
Cause di prolungamento
dell’APTT
• Carenze congenite dei fattori PK, HMWK, XII, XI,
IX, VIII, X, V, II o fibrinogeno
• Carenze acquisite di uno o più fattori di cui sopra
a seguito di:
− Coagulopatia da consumo
− Epatopatie
− Assunzione di anticoagulanti orali e/o trattamento
con eparina
− Presenza di anticoagulanti circolanti
Ex
ic pa trins
r in s ay thw ic
Int thw ay
pa

HMWK
Prekallikrein
Factor XII Fattore Tissuatle
Ac

Factor XI Factor VII


t

Factor IX
iva

Factor VIII
te
d

e
pa

tim
rti
al

n
bi
th

Common

om
ro

pathway
m

hr
bo

ot
Pr
Factor X
pl
as

Factor V
tin

Factor II
tim

Factor I
e

Fibrin
(urea soluble)
+
Factor XIII
Factor XIII
measurement

Fibrin
(cross linked)
Terapia Eparinica
Terapia Eparinica
Scopi
• Trattamento
− Arresta il processo trombotico in
atto, pur assicurando un livello
emostatico adeguato
• Profilassi
− Previene la trombosi in situazioni a
rischio, pur assicurando un livello
emostatico adeguato
Eparina Meccanismo
Legame con Antitrombina (AT)

FXIIa

FXIa
AT-Eparina
FXa

FIIa

Fibrinogeno Fibrina
Terapia Eparinica
Tipi di Eparina

• Eparina non frazionata (alto peso molecolare)

• Eparina frazionata (basso peso molecolare)


Terapia Eparinica
Eparina non Frazionata

• Trattamento della trombosi


- Necessita di Controllo di Laboratorio
(APTT) per aggiustare la dose e
mantenere il paziente nell’intervallo
terapeutico
• Profilassi
- In generale non necessita di controllo di
laboratorio
Terapia Eparinica
Eparina a Basso Peso Molecolare

• Trattamento della trombosi


- In generale non necessita di controllo di
laboratorio per aggiustare la dose
• Profilassi
- Non necessita di controllo di laboratorio
Terapia Anticoagulante Orale
Terapia Anticoagulante Orale
• Scopo della terapia
- Previene la trombosi, assicurando un livello
emostatico adeguato
• Intervallo terapeutico
- Livello di anticoagulazione efficace e sicuro
• Controllo di laboratorio
- Test per giudicare il livello di
anticoagulazione e regolare la terapia
Farmaci Anticoagulanti Orali

• Quali
- Warfarina (Cumadin)
- Acenocumarolo (Sintrom)
• Come funzionano
- Inibiscono la vitamina K,
determinando una ipofunzione dei
fattori IX, VII, X e II
γ -carbossilazione mediata
dalla Vitamina K
Precursore Fattore Attivo
H H O
H H O

N C C
N C C

CH2
Vitamina K CH2

CH
CH2

COOH COOH COOH


PT nel Controllo di Laboratorio della
Terapia Anticoagulante Orale
Perchè

• E’ sensibile (si allunga) a tutti i


fattori della coagulazione (eccetto il
fattore IX) depressi dalla terapia
• E’ facile e veloce da eseguire
• Costa relativamente poco
PT nel Controllo di Laboratorio della
Terapia Anticoagulante Orale

Problemi
• Diverse tromboplastine
- Sensibilità variabile al difetto
indotto
dalla terapia
- Dipendenza dal coagulometro
PT nel Controllo di Laboratorio
della Terapia Anticoagulante
Orale
Soluzione
• Espressione del risultato come rapporto
internazionale normalizzato (INR)

ISI
PT (sec) Paziente
INR =
PT (sec) Normale
Livelli di Anticoagulazione e INR

Inadeguato
Adeguato
Eccessivo

1 2 3 4 5 6
INR
Principali Indicazioni per la
Terapia Anticoagulante Orale

• Profilassi del Tromboembolismo Venoso


• Valvole meccaniche
• Fibrillazione Atriale
• Prevenzione del reinfarto
Numero di Pazienti in Terapia
Anticoagulante Orale
Circa 1% della popolazione
generale