Determinacin cuantitativa de protena

en muestra problema por medio de

mtodos espectrofotomtricos
Bioqumica Experimental
Grupo 5
Equipo 5

vila Jaimes Vernica

Becerril Romn Mara del Mar J.

Toro Jaimes Jorge Oswaldo.

Corona Ortega Luis ngel

Romn
Resumen
Se llev a cabo la cuantificacin de la protena contenida en una muestra problema por medio de
la elaboracin de una curva estndar a partir de albmina srica bovina (BSA). Se emple el
mtodo de Lowry que consiste en la formacin de un color azul dado por iones metlicos en
solucin reducidos por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina presentes en la
protena estudiada. Se midi la absorbancia de las disoluciones en un espectrofotmetro a 750
nm
Introduccin
La colorimetra es cualquier anlisis que permita el clculo de una concentracin a partir de la
medicin de la absorbancia de un cromforo coloreado, es decir, que absorba en la regin
del visible y rena unas caractersticas tales que se pueda aplicar la ley de Lambert-Beer.
Una de las colorimetras ms utilizadas en Bioqumica es aquella conocida como mtodo de
Lowry. Se basa en que los grupos fenlicos de las tirosinas presentes en las protenas
reducen al reactivo de Folin-Ciocalteau (una mezcla de sales de tungstato y molibdato que,
en su forma oxidada, es de color amarillo). Adems, se aade cobre para que: a) desdoble a
la protena al formar enlaces de coordinacin y b) acelere la reaccin entre los grupos
fenlicos (que son oxidados a quinonas) y el reactivo de Folin-Ciocalteau (que al reducirse
es de color azul plido).
Variables
Variables controladas: cantidades de reactivo A y B,
longitud de onda empleada (750 nm).

Variable independiente: cantidad de BSA.

Variable dependiente: absorbancia a 750 nm.
Hiptesis
Si el producto derivado de la reaccin de la BSA con el reactivo de Folin-
Ciocalteau cumple con la ley de Lambet-Beer, entonces el valor de la
absorbancia ser directamente proporcional a la cantidad de BSA en la
muestra.
Objetivos
Realizar una curva patrn de Albmina Srica Bovina (BSA), utilizando el
espectrofotmetro.
Determinar la concentracin de protenas en una muestra problema, utilizando los datos de
la curva patrn.
Materiales y reactivos
Material:
Celdas de metacrilato grado UV para espectrofotmetro
Tubos de microfuga
1 gradilla para tubos de microfuga
1 caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta.
1 caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta.
1 Micropipeta 10 L
1 Micropipeta 20-200 L
1 Micropipeta 200-1000 L
Vrtex
Espectrofotmetro (por grupo)

Materiales y reactivos
Reactivos:
Albmina de suero bovino (BSA) a una concentracin de 1 mg/mL.
Solucin problema de protenas (los profesores la proporcionarn)
Solucin de carbonato-tartrato-cobre (CTC; 10% Na
2
CO
3
, 0.1 % CuSO
4
y 0.2 % de tartrato de Na
+
y K
+
)
10% Dodecilsulfato de sodio (SDS)
0.8 N NaOH
Reactivo A.
Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC, 10% SDS,
0.8 N NaOH y H
2
Odestilada.
Reactivo B.
Dilucin del reactivo de Folin- Ciocalteu. 1 volumen de reactivo + 5 volmenes de H
2
O.
Guardar en frasco mbar. Preparar preferentemente poco antes de usarse.

Procedimiento
Tabla 1. Reactivos y cantidades para realizar la determinacin de
protenas utilizando el mtodo de Lowry.

Resultados
Tubo HO (L) BSA (1mg/mL)
Reactivo A
(L) Reactivo B (L) A 750nm
1 450 0 500 250 0
2 445 5 500 250 0.119
3 440 10 500 250 0.13
4 435 15 500 250 0.149
5 430 20 500 250 0.212
6 425 25 500 250 0.322
7 420 30 500 250 0.348
8 415 35 500 250 0.456 Cantidad de protena (g)
9 425 25 500 250 0.203 16.25
10 400 50 500 250 0.277 22.4
Tabla 1.1 Reactivos y cantidades aadidos para realizar la curva
patrn de BSA y la determinacin de la concentracin de protenas
de una muestra problema, utilizando el mtodo de Lowry.
Resultados
y = 0.0116x + 0.0744
R = 0.9335
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0 5 10 15 20 25 30 35
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Cantidad de Protena (g)
Curva Estndar de BSA
Grfica 1.1 Valores de absorbancia de las muestras de BSA en funcin de la
cantidad de protena para la construccin de una curva estndar.
Resultados
Algoritmo de clculo

Discusin

Conclusin
Escribe un breve resumen de los descubrimientos en funcin de los
resultados de los experimentos. Es necesario indicar si los datos
refuerzan la hiptesis y explicar las razones para que lo hagan o no.
Obras citadas
Badui, S. D.: Qumica de los alimentos 3ed. Alambra Mexicana,
Mxico D.F: 2004.188-189
Garca-Segura, Juan Manuel et al. :Tcnicas instrumentales de
anlisis en Bioqumica 3reimp. Sntesis, S.A. Madrid, Espaa: 2007.
110-111