Fundao Universidade Federal do Rio Grande

Instituto de Oceanografia
Disciplina de Poluio Marinha
talo Braga de Castro
CROMATOGRAFIA
(aula 1)
Definio:
um mtodo fsico-qumico de separao dos
componentes de uma mistura por interao entre
uma fase estacionria e uma fase mvel.
Fase Estacionria: slido (ou lquido impregnado com
slido) que permanece dentro da coluna de separao.

Fase Mvel: solvente (gs ou lquido) que se move atravs
da coluna, carregando os solutos.
Histrico:
M. TSWEET (1903): Separao de misturas de
pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes slidos e solventes variados.
ter de
petrleo
CaCO
3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever]
(grego)
Princpio:
1-De acordo com o sistema cromatogrfico

Em Coluna

Cromatografia Lquida
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Supercrtica

Planar

Cromatografia em Camada Delgada (CDC)
Cromatografia em Papel (CP)


Classificao:
2-De acordo com a Fase Mvel
Utilizao de Gs
Cromatografia Gasosa (CG)
Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo (CGAR)

Utilizao de Lquido
Cromatografia Lquida Clssica (CLC)
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Utilizao de Gs Pressurizado
Cromatografia Supercrtica (CSC)
Classificao:
3-De acordo com a Fase Estacionria
Lquida
Slida
Quimicamente Ligadas

4-De acordo com o Modo de Separao
Por adsoro
Por partio
Por troca inica
Classificao:
Mecanismos de separao:
Processos fsicos -> Soro
atraes polares
S
CROMATOGRAFIA
Em coluna Planar

L
L F L
CP CCD
CCD
Gs
L
S
F L
CGL
CGS
CGFL
Fludo supercrtico
F L L
CSS
CSFL
Lquido
L
S
CLL
CLS
CE
F L
CLFL CTI CB
Tipos de Cromatografia
Fase Mvel
Tcnica
Fase Estacionria
Classificao:
- Cromatografia Planar Lquido-lquido
- Princpio: partio relaciona a diferena de
solubilidades dos componentes de uma mistura, na fase
mvel e fase estacionria;
- Tipos: ascendente, descendente, bidimensional,
circular
- Anlise qualitativa: Rf (fator de reteno);
Rf = distncia percorrida pela substncia
distncia percorrida pela fase mvel
Cromatografia em Papel:
Mtodo rpido (20-40 min.)
Uso de diversos agentes cromognicos
Maior sensibilidade que C.P. (10
-9
g)
Grande gama de compostos pode ser analisada
Mtodo simples e barato
F.M. - sistema de solventes
F.E - Adsorventes (slica, alumina, celite, amido)
Mtodos de deteco: fsico-qumicos
Princpio: Adsoro (polaridade)
Cromatografia em camada delgada:
Pode ser tambm chamada de cromatografia lquida clssica.
FE slica e alumina;
FM eluente;
PRINCPIO: adsoro
Cromatografia em coluna:
FASE MVEL
injeo separao eluio
Fase
estacionria
DETECTOR
Cromatografia Gasosa:
Em CG a FE
pode ser:
Slida
Lquida
Cromatografia
Gs-Slido (CGS)
Cromatografia
Gs-Lquido (CGL)
FE slida com uma grande rea superficial e a
separao baseia-se em mecanismos de
adsoro das substncias neste slido.
FE lquida pouco voltil recobrindo um suporte
slido ou as paredes da coluna capilar. A
separao baseia-se em mecanismo de partio
das substncias entre a fase lquida e gasosa.
Cromatografia Gasosa:
Rapidez
Alto poder de separao
Separao de vrias classes
de compostos em uma
anlise
Sensibilidade (ppm - ppb)
Facilidade de registrar dados
Variedade de detetores
(especificidade)
Amostras volteis
Compostos termicamente
estveis
Tcnicas auxiliares p/
identificao
Cromatografia Gasosa:
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejam
VOLTEIS (evaporveis)
(para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um fluxo
de um gs ela deve se dissolver - pelo menos parcialmente - nesse
gs)
DE FORMA GERAL:
CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300
o
C e que
sejam termicamente estveis.
Cromatografia Gasosa (Aplicaes):
Ambiental
Pesticidas, organoclorados e PCBs
Hidrocarbonetos
Aminas e fenis
Alimentos
Anlise de cidos graxos e triglicerdeos
Anlise de compostos volteis responsveis pelo aroma caracterstico
de alimentos
Anlise de acares e aminocidos
Farmacutica
Qumica Forense/Toxicologia
Doping
Metablitos de drogas
Qumica Industrial
Petroqumica

Cromatografia Gasosa (Aplicaes):
Cromatgrafo de Fase Gasosa:
1
2
3
4
6
5
Cromatografia Gasosa:
1 - Reservatrio de Gs e Controles de
Vazo / Presso.
2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.
3 - Coluna Cromatogrfica e Forno da
Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrnica de Tratamento de Sinal.
6 - Registro
Gs de Arraste:
Fase Mvel em CG: NO interage com a amostra - apenas a carrega atravs
da coluna. Assim usualmente referida como GS DE ARRASTE
Requisitos:
INERTE No deve reagir com a amostra, fase estacionria ou superfcies
do instrumento.
PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase
estacionria.
Impurezas tpicas em gases e seus efeitos:
oxida / hidroliza algumas FE
incompatveis com DCE
H
2
O, O
2
hidrocarbonetos
rudo no sinal de DIC
Requisitos:
CUSTO Gases de altssima pureza podem ser muito caros.
COMPATVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um
gs de arraste especfico para melhor funcionamento.
C
U
S
T
O

PUREZA
A
B
C
A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
Gs de Arraste:
Componentes necessrios linha de gs:
controladores de vazo / presso de gs
dispositivos para purificao de gs (traps)
1
2
3
4
5
6
1 - Cilindro de Gs
2 - Regulador de Presso Primrio
3 - Traps para eliminar impurezas do gs
4 - Regulador de Presso Secundrio
5 - Regulador de Vazo
6 - Medidor de Vazo (Rotmetro)
Nota: Tubos e Conexes: Ao Inox ou Cobre
Gs de Arraste:
1
2
3
4
1 - Septo (silicone)
2 - Alimentao de gs de arraste)
3 - Bloco metlico aquecido
4 - Ponta da coluna cromatogrfica
Injetor:
Injeo:
TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para
que a amostra vaporize imediatamente, mas sem ocasionar a sua
decomposio.
Regra Geral: T
inj
= 50
o
C acima da temperatura de
ebulio do componente menos voltil
VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado
fsico da amostra
COLUNA
Amostras
Gasosas
Amostras
Lquidas
empacotada
= 3,2 mm (
1
/
4
)
0,1 ml ... 50 mL 0,2 L ... 20 L
capilar
= 0,25 mm
0,001 ml ... 0,1 mL 0,01 L ... 3 L
Slidos: convencionalmente se dissolve em um
solvente adequado e injeta-se a soluo
Injeo:
mbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Microseringa de 10 L:
Microseringa:
EMPACOTADA
= 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com slido pul-
verizado (FE slida ou FE
lquida depositada sobre
as partculas do recheio)
CAPILAR
= 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recober-
tas com um filme fino (fra-
o de m) de FE lquida
ou slida
Colunas:
Colunas (parmetros):
Alm da interao com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer
a coluna depende de sua PRESSO DE VAPOR (p
0
).
p
0
= f
Estrutura qumica
do analito
Temperatura
da coluna
Temperatura
da
coluna
Presso
de
vapor
Velocidade
de
migrao
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR
RETENO)
T
E
M
P
E
R
A
T
U
R
A

D
A

C
O
L
U
N
A

CONTROLE CONFIVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA
ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAO EM CG
Colunas (parmetros):
Dispositivos que examinam continuamente o material eludo, gerando sinal
quando da passagem de substncias que no o gs de arraste
Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substncia separada aparece
como um PICO no cromatograma.
Detectores:
UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer
substncia eluda.
SELETIVOS: Detectam apenas substncias com
determinada propriedade fsico-qumica.
ESPECFICOS: Detectam substncias que possuam
determinado elemento ou grupo funcional em suas
estruturas
Detectores:
~ 60 detectores j usados em CG
~ 15 equipam cromatgrafos comerciais
4 respondem pela maior parte das aplicaes
DCT TCD
Detector por
Condutividade
Trmica
DIC FID
Detector por
Ionizao em
Chama
DCE ECD
Detector por
Captura de
Eletrons
EM MS
Detector Es-
pectromtrico
de Massas
Detectores:
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU TCD)
um Detector de 2 canais
mede a diferena, em Condutividade Trmica , entre o Gs
de Arraste (Referncia) e o do Gs de Arraste + Amostra
(analtico)
possui 2 pares de filamentos, 1 em cada canal , formando
uma ponte.
As vazes dos 2 canais devem ser praticamente iguais
A presena de um componente, dissolvido no Gs de
arraste, ao atingir o canal analtico muda a resistncia deste
filamento , provocando um desequilbrio na ponte que gera
um sinal proporcional a quantidade deste
A sua sensibilidade depende da corrente do Filamento ,
concentrao dos componentes e da diferena da
Condutividade Trmica entre o Gs de arraste e o
componente .

TCD:
DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID) .
Detectores:
baseia-se no princpio de que a concentrao de
um composto diretamente proporcional a
concentrao das partculas ionizadas presentes no
mesmo
O Gs de arraste e os componentes que eluem da
Coluna atingem a chama . Esta ioniza (queima) as
molculas orgnicas presentes na corrente gasosa .
As partculas ionizadas, entre os eletrodos, gera
uma corrente que medida atravs de uma
resistncia


Hydrogen in
Air in
Collector
Flame jet
Column connection
FID:
DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD)
Detectores:
um Detector seletivo, especfico para anlises de Compostos
Eletroflicos (como os Halognios nos Clorados) .
A cela do ECD revestida internamente por uma lmina do
istopo radioativo de Ni-63.
As Partculas Beta emitidas pelo istopo ionizam o Carrier e
os ons e Eltrons resultantes migram para o anodo coletor por
influencia de uma voltagem polarizada pulsante , aplicada
entre a fonte e o coletor
A freqncia de pulsao controlada para manter a corrente
constante e a geradora do sinal analtico .
um Detector no destrutivo e altamente sensvel, ideal para
anlise de pesticidas e agrotxicos clorados
Collector
63
Nickel foil
Make-up gas in
Column connection
ECD:
Detectores:
DETECTOR POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
A GC/MS uma tcnica analtica , tambm bastante conhecida, que
visa identificar positivamente e ou quantificar os componentes de
uma mistura .

Os componentes da amostra, previam. separados no GC, so
transferidas p/ o MS, atravs De uma linha de transferncia.

No MS ocorre a fragmentao da molcula e a deteco,
possibilitando ao usurio o detalhamento da estrutura e o peso
molecular do composto.

Utilizando uma biblioteca especfica podemos identificar
positivamente o composto, baseado na abundncia dos seus
fragmentos (ions) .
Espectro de Massa (TBT):

CROMATOGRAFIA LQUIDA CLSSICA (CLC)
CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA RESOLUO
(CLAE)
Cromatografia Lquida:
Esquema para CLC:
Preparo da coluna
Aplica-se a amostra
Eluente
Deteco e quantificao (espectroscopia ou gravimetria)
Cromatografia Lquida:
Esquema para CLAE:
Coluna fechada
Injeo de amostra
Detector
Cromatogramas
Cromatografia Lquida:
Caractersticas da Fase Mvel usada em CLAE:
Alto grau de pureza ou de fcil purificao;
Dissolver a amostra sem decompor os seus
componentes;
No decompor ou dissolver a FE;
Ter baixa viscosidade;
Ser compatvel ao detector utilizado;
Ter polaridade adequada para permitir uma separao
dos componentes da amostra.
Cromatografia Lquida de Alta Resoluo:
Tipos de amostras que podem ser analisadas por CLAE:
aminocidos;
explosivos;
lipdeos polares;
metablicos de animais e plantas;
pigmentos de plantas;
produtos farmacuticos;
protenas;
tintas.
Cromatografia Lquida de Alta Resoluo:
FATOR

CG

CLAE

Requisitos para amostra

Amostra voltil ou
derivatizvel, termicamente
estvel na temperatura de
operao do sistema
cromatogrfico.
Amostra solvel na fase
mvel.

Tipos de amostras

Gases, lquidos ou slidos
MM: 2 a 1200

Lquidos e slidos, inicos
ou covalentes. MM: 32 a
4.000.000

Quantidades mnimas
detectveis

10
-12
g

10
-9


Tempo de anlise

Minutos at poucas horas

Minutos at poucas horas

Capacidade analtica

Excelente, separao de
amostras com at 200
componentes.

Excelente, separao de
amostras com at 50
componentes.

Tempo de treinamento
para um operador

Cerca de 3 meses.

Pelo menos 6 meses.

Comparao entre CG e CLAE:
A migrao de um
analito pela coluna
provoca inevitavelmente
o alargamento da sua
banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
Separao deficiente de analitos
com retenes prximas.
Picos mais largos e menos
intensos = menor
detectabilidade
EFICINCIA Capacidade de eluio com o mnimo de
disperso do analito.
Eficincia dos sistemas cromatogrficos:
Fontes de Informaes Qualitativas
RETENO Uso de dados de reteno de um analito para sua
identificao
DETECO Detectores que fornecem informaes estruturais sobre as
substncias eludas
Identificao individual das espcies
contidas na amostra
Determinao da identidade da amostra
propriamente dita
Aplicaes
Qualitativas de
CG
Para anlise qualitativa confivel por CG recomendvel
combinao de dados provenientes de pelo menos duas
fontes
Anlise Qualitativa:
t
R
= f
Interaes analito / FE
Presso de vapor do analito
Condies operacionais
Fixas as condies operacionais, o tempo de reteno ajustado
de um analito uma constante
AMOSTRA
PADRO
Comparao de
cromatogramas da
amostra e de uma
soluo padro do
analito suspeito
Anlise Qualitativa: (tempos de reteno)
Mtodos de deteco que fornecem informaes qualitativas sobre os
analitos eludos:
Cromatografia Gasosa com Deteco
Espectromtrica por Absoro no Infra-
Vermelho (CG-EIV)
Cromatografia Gasosa com Deteco
Espectromtrica de Massas (CG-EM)
Cromatografia Gasosa com Deteco
Espectromtrica por Emisso Atmica (CG-EA)
Identificao muito confivel quando combinados a tcnicas de
identificao baseadas em reteno
Anlise Qualitativa: (mtodos de deteco)
Padres cromatogrficos:





Padres







Externos (Identificao)

Internos (Quantificao)

Surogates (Recuperao)
Controle de Qualidade dos dados:
Programas de Intercalibrao

Materiais de referncia
RT: 6.00 - 15.00
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
A
b
u
n
d

n
c
i
a

r
e
l
a
t
i
v
a

10.43
12.91
10.15
11.78
11.34
12.51
10.67 8.01 9.51 13.69 8.82 14.75
7.08 14.39
Cromatogramas:
Cromatogramas: