TECNICAS DE SEPARACIN

DE PROTENAS
ALUMNA : MARIA HERLINDA ARANDA
RAMIREZ
DOCENTE: MARCO MESIA GUEVARA
CICLO : I
TURNO : NOCHE
Las protenas se encuentran entre las macromolculas
biolgicas ms abundante y verstiles en cuanto a sus funciones.
Casi todo lo que sucede en la clula requiere la intervencin de
una o ms protenas. Las protenas proporcionan estructura,
catalizan reacciones qumicas, transportan molculas o iones
especficas, defienden al organismo contra la invasin de otras
especies, ayudan a regular la actividad celular y gran cantidad
de funciones esenciales para el desarrollo de la vida.
Por lo tanto, para
pasar de una clula
o tejido a una
protena purificada
no existe un nico
mtodo sino que se
utilizan diversas
tcnicas de modo
secuencial.
METODOS PARA LA SEPARACIN DE PROTEINAS
a) Mtodo de separacin basado en el tamao molecular
Dilisis y ultrafiltracin.
Gradiente de densidad.
Cromatografa de exclusin molecular.
Electroforesis en gel de poliacrilamina-SDS (SDS-PAGE)
b) Mtodos de separacin basados en la carga elctrica
Cromatografa de intercambio inico
Electroforesis
c) Mtodo de separacin basados en la diferencia de
solubilidad
Precipitacin isoelctrica
Fraccionamiento por solvente
d) Mtodos de separacin basados en la especificidad de
ligandos
Cromatografa de afinidad
a) Mtodo de separacin basados en el tamao molecular

1.a Dilisis y Ultrafiltracin
Las protenas pueden ser separadas de las molculas pequeas
por dilisis a travs de una membrana semipermeable. Las
molculas cuya masa es mayor que 15 Kg. Quedan retenidas,
mientras que los iones y las molculas pequeas atraviesan los
poros de la membrana de dilisis.

Estas membranas semipermeables tiene poros lo
suficientemente grandes para permitir que las molculas
pequeas pasen libremente pero que sean una barrera para las
protenas y otras macromolculas. En la ultrafiltracin se aplica
presin para hacer salir al solvente y a las molculas pequeas a
travs de la membrana, con lo que se concentran las
macromolculas.
1.b Cromatografa de exclusin molecular o Filtracin en
Gel.
La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de
molculas diferentes, presentes en una misma muestra. El
mtodo est basado en la circulacin de una fase mvil (que
arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a travs de una
fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por
ambas fases tengan los distintos compuestos presentes en la
mezcla resultar su separacin.

La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin
llamada filtracin en gel o de tamiz molecular) es una de las
tcnicas ms sencillas de las empleadas en la separacin de
protenas y cidos nucleicos. Este tipo de cromatografa se
realiza en columnas cilndricas rellenas con algunos de los geles
que se fabrican con este fn y que pueden ser de varios tipos.
1.C Electroforesis en gel de poliacrilamina-SDS (SDS-PAGE)

La electroforesis de protenas en geles con una matriz de
poliacrilamida, comnmente denominada electroforesis en
poliacrilamida (PAGE, Polyacrilamide gel electrophoresis) es sin
duda alguna una de las tcnicas ms ampliamente usada para
caracterzar mezclas complejas de protenas. La electroforesis
en poliacrilamida es un mtodo conveniente, rpido y econmico
a nivel de muestra pues se requieren slo cantidades del orden
de microgramos de protenas.

Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que
son qumicamente inertes, transparentes y estables en un
amplio rango de pHs, temperatura y fuerza inica (cantidad de
iones presentes en la solucin).
b) Mtodo de separacin
basados en la carga elctrica

Cromatografa de Intercambio
Inico.
La cromatografa de intercambio
inico separa las protenas de
acuerdo a su carga neta, la cual
depende la composicin de la
fase mvil. Ajustando el pH o la
concentracin de iones de la
fase mvil, varias molculas de
protena pueden ser separadas.
Electroferesis
Cuando una mezcla de molculas ionizadas son colocadas en un
campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin
hacia el polo que posee carga opuesta, as, las molculas
cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo
negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran
hacia el nodo (el polo positivo).

Fue empleado por
primera vez por A.
Tiselius en 1937.
El movimiento de las molculas esta gobernado tambin por
dos fuerzas adicionales: la friccin con el solvente dificultar
este movimiento originando una fuerza que se opone y por otro
lado las molculas tienen que moverse en forma aleatoria o
movimiento browniano debido a que poseen energa cintica
propia denominado difusin.

La energa cintica de las molculas aumenta con la
temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusin.
Para le electroforesis es mas conveniente utilizar un medio de
soporte, los ms utilizados son el papel y el gel.

La electroforesis en papel puede emplearse para separar
mezclas de molculas pequeas cargadas, se utiliza un papel de
filtro humedecido en solucin buffer o tampn para controlar el
Ph, entre dos cubetas que contiene electrodos. La muestra se
siembra en el papel y se aplica corriente elctrica. Cuando las
molculas se han desplazado durante un cierto tiempo, se retira
el papel, se seca y se tie con un colorante que permite ver las
sustancias de inters. Cada molcula cargada se desplazar a
una distancia determinada del nodo y el ctodo de acuerdo a su
carga y dimensiones. Las manchas pueden ser comparadas con
una serie de patrones conocidos que se corren en el mismo
papel.
La electroforesis en gel, se utiliza para la separacin de
protenas y cidos nucleicos. Se coloca un gel que contenga la
solucin tampn adecuada a modo de lmina entre dos placas de
cristal o acrlico. Los geles ms comunes se hacen con
poliacrilamida o con agarosa y se coloca entre los
compartimentos de los electrodos. La muestra se siembre con
una pipeta en una muestra que se ha practicado en el gel antes
de que este se solidifique. Se aade glicerol a la muestra para
conferirle densidad y tambin un colorante para evidenciar su
localizacin (el colorante migrar ms rpidamente y permitir
ver la evolucin de la corrida). Se retira el gel, se tie con un
colorante para proteinas o cidos nucleicos, (puede tomarse
una fotografa para guardar los datos). Los componentes que se
desplazan con movilidades diferentes aparecen como estrechas
bandas en el gel. La movilidad relativa de cada componente se
calcula a partir de la distancia que se ha desplazado con
relacin al colorante de localizacin.
c) Mtodo de separacin basados en la diferencia de
solubilidad
Precipitacin Isoelctrica
Las protenas en solucin muestran cambios profundos en su
solubilidad en funcin del pH, la fuerza inica, el solvente y la
temperatura. Cualquiera de estas variables puede ser usada
para separar una mezcla proteica dado que cada protena tiene
una composicin aminoacdica caracterstica que determina su
comportamiento como electrolito.
En el caso de la precipitacin isoelctrica, la separacin de las
proteinas se basa en que la solubilidad de la mayora de las
proteinas globulares se encuentra altamente influenciada por el
pH del sistema donde se encuentra. El pH en el cual una
proteina tiene una carga neta igual a cero se lo denomina punto
isoelctrico (pl) y es el pH en el cual la protena es menos
soluble. Bajo estas condiciones las protenas tienden a
agregarse y precipitar.
Dado que cada protena contiene una secuencia de aminocidos
particular, con grupos ionizables diferentes, cada una tiene un
punto isoelctrico caracterstico, y por lo tanto puede ser
separada del resto por precipitacin isoelctrica. En este caso
se ajusta el valor de pH al valor de pl de la protena que se
desea separar y se producir la precipitacin de la misma,
permaneciendo el resto en solucin.
d) Mtodo de separacin basados en la especificidad de
ligandos

Cromatografa de afinidad
Es una cromatografa que utiliza la alta especificidad de las
reacciones biolgicas del tipo antgeno-anticuerpo, hormona-
receptor.
Para ello un ligando de afinidad se une al soporte de la FE.
Cuando la muestra atraviese la columna solo se retendr la
sustancia capaz de reaccionar con dicho ligando. Una vez
concluida la separacin hay que provocar la salida de la
sustancia que dio la reaccin especfica.