PLASMIDOS

Tambin llamados plasmidios

Presentes normalmente en bacterias y las levaduras.
Caractersticas:
Son pequeos (miles de pares de bases)
generalmente portan solo uno o algunos genes
son circulares
tienen un nico origen de replicacin
no movilizables


PLASMIDOS: molculas de DNA que se encuentran en bacterias y se
replican y transcriben en forma independiente del cromosoma.


Para su utilizacin como vectores de clonado se requiere adems:


- Sitios nicos de clivaje para enzimas de restriccin
-gran numero de copias (por eliminacin de la
-regin de control)
-marcadores que permitan su reconocimiento




Ejemplos: pBR322, pUC19


Los genes codificados por plsmidos donan ciertos privilegios al husped
(resistencia a antibiticos, producir antibiticos, degradar compuestos
complejos, producir colicinas, entero toxinas, enzimas de restriccin y de
modificacin).

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Ap
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Origin of
replication
HindIII
BamHI
SalI
Tc
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LOS PLSMIDOS
ESTRUCTURA DE LOS PLSMIDOS

Pequeos trozos extracromosmicos de ADN circular cerradas covalentemente.

Se encuentran en forma superenrollada. El ADN as enrollado adopta una configuracin ms
compacta que el ADN menos enrollado y migra ms rpido en una electroforesis.

Algunos contienen una regin mvil denominada transposn, limitada por secuencias
altamente repetidas, le permite moverse al ADN cromosmico. La insercin de un
transposn a un gen interrumpe ese gen y codifica para rasgos parecidos, como por ejemplo
resistencia antibitica.

La relacin entre un transposn y su husped es semejante a la de un parsito y su
husped. La resistencia a penicilina y tetraciclina se ha diseminado ampliamente por
plsmidos que contienen transposones.
PROPIEDADES
1. Tamao pequeo (fcil de separar y
manipular).
2. DNA circular (DNA ms estable).
3. Origen de replicacin independiente.
4. Mltiple numero de copias.
5. Marcadores de seleccin tales como los
genes de resistencia a antibiticos.

La conjugacin es la forma de reproduccin sexual ms simple. Se produce cuando 2
clulas se unen e intercambian material gentico.
CONJUGACIN
TRANSFORMACIN DE BACTERIAS
Introducir un plsmido en una bacteria o levadura es transformar una bacteria, osea una
transformacin.
Para las clulas eucariotas (excepto las levaduras), no se dice transformar sino transfectar
(quiere decir hacerla eterna o cancerosa).
Existen varios mtodos para introducir un plsmido en una clula.
TRANSFORMACIN CON CACL2 + CHOQUE TRMICO
Consiste en aadir plsmidos a las bacterias tratadas con CaCl2 y someterlas a un breve
choque trmico (42C).
La utilizacin de otras sales de CaCl2 y adicin de iones metlicos aumenta la eficiencia
de la transformacin.
Para plsmidos de 3 kb, una transformacin eficaz produce alrededor de 10+8
colonias/mg de ADN plasmdico superenrrollado.

ELECTROPORACIN
Consiste en someter las bacterias suspendidas en agua a una diferencia de potencial elevado
para perforar temporalmente la pared celular.
Transformacin de
bacterias por el
plsmido.

TIPOS

Existen varios tipos de plsmidos,
clasificados de acuerdo al tipo de genes
que transportan y son:


El plsmido F
("factor sexual")

El plsmido R
("factor resistencia")

F ("factor sexual")
En Escherichia coli el plsmido F
contiene 25 genes, algunos de los
cuales controlan la produccin de los
pilis , "tubos" que se extienden desde
la superficie de las clulas
bacterianas "machos"( F+), a la de
las clulas bacterianas hembras ( F-).

Episoma

Se denomina episoma a un plsmido
incorporado al cromosoma
bacteriano. Los plsmidos se replican
en manera similar al cromosoma
bacteriano.
El plsmido R
El plsmido R confiere, a las clulas que lo poseen,
resistencia a los antibiticos o drogas.

Puede llegar a tener hasta 10 genes que confieren
resistencia y que pueden transferirse.

La resistencia a los antibiticos ha sido encontrada en
grmenes patgenos causantes de enfermedades tales
como: tifoidea, meningitis, gonorrea y otras. Actan
proporcionando la informacin necesaria para destruir el
antibitico o para circunvalar el bloqueo que produce el
antibitico en la va metablica bacteriana.



FUNCIONES DETERMINADOS POR
PLSMIDOS:

Resistencia a antibiticos .
Resistencia a metales pesados (por ejemplo, resistencia a mercurio).
Plsmidos de virulencia: produccin de toxinas, factores de
penetracin en tejidos, adherencia a tejidos del hospedador, etc., en
ciertas bacterias patgenas.
Produccin de bacteriocinas (protenas txicas producidas por
bacterias que matan a otras de la misma especie).
Produccin de siderforos (quelatos para secuestrar iones Fe3+).
Utilizacin de determinados azcares.Utilizacin de hidrocarburos,
incluyendo algunos cclicos recalcitrantes (degradacin de tolueno,
xileno, alcanfor, etc.)
En Pseudomonas.Induccin de tumores en plantas (plsmido Ti de
Agrobacterium tumefaciens).Interacciones simbiticas y fijacin de
nitrgeno en ciertos Rhizobium. etc...
MAS UTILIZADOS

ADN RECOMBINANTE
TERAPIA GENICA
ALIMENTOS TRASNGENICOS
VACUNAS


CAPTURANDO EL GEN

1. Se extrae ADN de muchas clulas, y se corta en pequeas piezas.











Capturando el Gen

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3. Los plsmidos, colocados de nuevo en
bacterias, son ahora distintos, y entonces
pueden ser separados.

4. Ahora, cada pieza de ADN puede copiarse
tanto como sea necesario.
2. Las piezas se mezclan con plsmidos cortados
con la misma enzima, las cuales al conjugarse
conforman distintos plsmidos.
1. Los plsmidos usados en la bacteria (vectores
clonados), tambin contienen un gen de resistencia
a antibiticos, de manera que solo aquellas que
tengan el nuevo plsmido recombinante, crecern
en el medio de cultivo. Este gen se llama "marcador
selectivo".

ENCONTRANDO EL GEN
CORRECTO

2. Cada clon (progenie de bacterias con la
nueva secuencia de ADN), puede ser
probada para saber si contiene el gen
deseado. Hay diversas maneras,
dependiendo del carcter en cuestin.
La construccin


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LA CONSTRUCCIN

1. Los genes deben "estar prendidos" para expresarse; para eso se usa el promotor.
2. El ARNm debe ser modificado para salir del ncleo, con los terminadores.
3. Es necesario saber cuales (poco frecuentes) clulas han sido
modificadas; para eso se agrega un gen marcador selectivo.
4. La combinacin terminada del gen + promotor + marcador
selectivo + terminadores, se llama construccin o inserto.
LO QUE ACOMPAA AL GEN:

VECTOR : molecula de DNA en la que
puede insertarse DNA exgeno para que
pueda replicarse en una celula apropiada
Plasmidos,
bacteriofagos
virus de animales y plantas
cromosomas artificiales

FUNCION COMO VECTORES
INGENIERA GENTICA:

TCNICA

PROPSITO
Enzimas de Restriccin Cortan ADN en puntos especficos, hacen fragmentos de ADN
ADN Ligasa Une fragmentos de ADN
Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las clulas y aseguran replicacin
Plasmidos Clase comn de vector
Marcadores Genticos Identifican a las clulas que han sido transformadas
PCR Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeas
ADNc Hace una copia de ADN de ARN mensajero
Sondas de ADN Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta secuencia
Sntesis Gnica Para hacer un gen de una base de datos
Gel Electroforsis Para separar fragmentos de ADN
Secuenciacin de ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN
PROCESO
DE
CLONACION
Copyright 2002 Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings
Fig. 20.3

Bacteria Clula con gen de
inters.
ADN
recombinante
Clulas se clonan y se
eligen para su
aplicacin posterior.
PLASMIDOS CON ADN RECOMBINANTE