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b.

RETROTRASCRIZIONE
TRASCRIZIONE INVERSA: nel citosol, consente di sintetizzare DNA a
doppio filamento a partire dal genoma a RNA di HIV.

FORMAZIONE DEL DNA PROVIRALE

• costituita da p51 e p66


• La sua attività richiede
la presenza di Mg++ e
la presenza di un
innseco a RNA, cioè il
tRNAlys contenuto nel
capside di HIV
• No proof-reading:
tasso di errore 
1/2000-10000 basi
RETROTRASCRIZIONE e
TRASPORTO NEL NUCLEO
1. Sintesi di una molecola complementare di DNA a
partire dall’RNAss.
2. catena ibrida DNA-RNA
3. RNasi H degrada l’RNA dell’ibrido
4. sintesi del filamento complementare di DNA

FORMAZIONE DEL DNA PROVIRALE

Il DNA provirale è quindi trasportato nel NUCLEO,


mediante passaggio attraverso i pori nucleari
DNA provirale
c. Trasporto del DNA provirale nel nucleo

DNA provirale

vpr:
• è una proteina di 15 KDa
• è contenuta nel virione maturo
• trasporta nel nucleo, dopo la retrotrascrizione, il DNA virale (pori nucleari)
d. INTEGRAZIONE

Avviene ad opera dell’enzima INTEGRASI. Il DNA provirale si integra


in posizione casuale nel genoma della cellula ospite
e. TRASCRIZIONE e FORMAZIONE
DELL’RNA GENOMICO VIRALE
• Sintesi dell’RNA dal DNA provirale integrato è operata dall’enzima
cellulare RNA-polimerasi II

• U3:
U3 Forma l'estremità 5’ del genoma provirale. Contiene gli elementi
promoter per la trascrizione del provirus (TATA box, CAT box, siti di
legame per fattori trascrizionali)
• U5:
U5 Contiene i segnali di fine trascrizione
• Proteine precoci: Tat, Rev, Nef
• Proteine tardive: gag, pol, env, vif, vpr, vpu
tat : è il principale enancher della
trascrizione di HIV
• 86 aa, 14 kDa
• dopo essere stata sintetizzata nel citosol, rientra nel
nucleo, dove svolge la sua funzione
• potente attivatore della TRASCRIZIONE
• si lega alle sequenze TAR (Tat Responsive Element) al
5’ degli mRNA nascenti aumentando l’attività della RNA
polimerasi II cellulare
• in assenza, la trascrizione sarebbe inefficiente
f. TRADUZIONE E FORMAZIONE DELLE
PROTEINE VIRALI

Avviene nel citosol, ad opera del complesso di


traduzione della cellula ospite e segue la sequenza
di trascrizione dei differenti mRNA:

1. Tat, Rev, Nef: proteine precoci

2. Gag, Pol, Env, Vif e Vpu: proteine tardive


ENV

ENV: envelope

gp160

gp120 gp41
(SU) (TM)

Legame con il recettore Fusione del virus con


delle cell CD4+ la cellula ospite
GAG
GAG: group specific antigen

p55

p15 p17 p24 (CA): principale


(MA) costituente NC

p7 p9

Stabiliscono legami con


l’RNA
POL

POL: polymerase

p31
Proteasi p12 p66
(IN)
Endonucleasi-
(PR) (TI) integrasi
Trascrittasi
inversa
g. ASSEMBLAGGIO e
FUORIUSCITA DEL VIRUS
HIV e AIDS: STORIA

• AIDS  zoonosi: sembra che SIV abbia superato la barriera di


specie (scimmia-uomo) nel secolo XIX e si sia diffuso in Africa
(passaggi seriale hanno reso possibile l’adattamento di questo virus
agli uomini)

• 1981 (Stati Uniti) --> aumento inspiegabile e improvviso dei casi di


polmoniti da Pneumocystis Carinii e Sarcoma di Kaposi in giovani
maschi omosessuali

• 1982: primi casi in individui soggetti a trasfusioni di sangue e primo


caso di trasmissione materno-fetale. Per la prima volta si parla di
Sindrome da Immunodeficienza Acquisita
UN PO’ DI STORIA..
Isolamento dell’agente infettivo:

• Science, 1983: il virologo francese Luc Montagnier (Istituto Pasteur, Parigi) riporta l’isolamento di un
nuovo virus che potrebbe essere l’agente responsabile della trasmissione della malattia. Il virus viene
isolato dalle cellule coltivate in laboratorio di un paziente omosessuale con linfonodi ingrossati. Il virus
viene denominato Lav (Virus associato a linfoadenopatia)

• Science, 1984: Robert Gallo, direttore del laboratorio di biologia cellulare dei tumori del National
Cancer Institute, riporta l’isolamento da pazienti malati di Aids di un retrovirus, candidato a essere il
responsabile della malattia, chiamandolo HTLV-III (Virus umano della leucemia a cellule T di tipo III).

• Inizia così una vera e propria battaglia legale fra i due prestigiosi istituti di ricerca, che rivendicano
entrambi la paternità della scoperta

• 2008: Luc Montagnier vince il premio nobel in fisiologia e medicina


Vie di trasmissione di HIV:

• sessuale= modalità di contagio prevalente nel mondo

• parenterale= scambio di siringhe infette

• trasfusioni= riduzione sostanziale in seguito


all’introduzione dei test di screening per Ab specifici
per HIV

• verticale= da madri infette ai figli


• TRASMISSIONE VERTICALE

23% Trasmissione intrauterina

Trasmissione intrapartum

Allattamento al seno
12% materno
65%
EPIDEMIOLOGIA
PATOGENESI

CELLULE TARGET:
• cellule T CD4+,
• cellule dendritiche,
• cellule monocito-macrofagiche

PROGRESSIVA DISTRUZIONE DELLE


CELLULE DEL SISTEMA IMMUNITARIO CHE
PORTA AD UNA FASE TERMINALE DEFINITA
AIDS
Virus destroys the cell as
a result of budding

1.
PUNCTURED
Infected CD4
cell Cells Fuse
Gp120 positive

Uninfected
Killing of CD4 cells CD4 cell
2. Syncytium Gp120
Formation negative
Cytotoxi
c T cell

Killing of CD4 cells


3. Cytotoxic T cell-mediated
lysis
Killing of CD4+ cells
4. Binding of free
Gp120 to CD4
antigen makes
uninfected T4
cell look like an
infected cell
Complement-
mediated lysis
LE TRE FASI DELL’INFEZIONE
DA HIV

infezione acuta AIDS


primaria
latenza clinica
INFEZIONE ACUTA PRIMARIA
• periodo immediatamente successivo al contagio

• FASE ASINTOMATICA. SINDROME SIMIL-


INFLUENZALE O SINDROME SIMILE ALLA
MONONUCLEOSI. FREQUENTE LINFOADENOPATIA

• VIREMIA: elevata replicazione virale e diffusione del virus


nell’organismo

Linfociti T CD4+
RNA virale
LATENZA CLINICA

• LATENZA CLINICA: ASINTOMATICA

• VIREMIA: BASSA O ASSENTE

• DIMINUZIONE lenta ma continua dei CD4, che vengono lisati


dal virus ma anche ricostituiti
Perchè il sistema immunitario non
riesce a eradicare l’infezione?

1) Presenza di reservoir cellulari e anatomici

- reservoir anatomici: sistema nervoso centrale e apparato genitale maschile


- reservoir cellulari: linfociti T CD4+ quiescenti
• HIV si replica in modo produttivo solo nelle cellule T attivate, mentre nelle
cellule T naive e nelle cellule T della memoria (quiescenti), il virus rimane in
forma latente
• In alcuni casi, le cell T attivate e infettate possono sopravvivere e
trasformarsi in cell T della memoria, dove quindi il virus può sopravvivere sotto
forma di provirus
Il virus non può mai essere eradicato completamente
dal corpo
Perchè il sistema immunitario non
riesce a eradicare l’infezione?

2. Insorgono mutazioni negli epitopi bersaglio del


virus  TASSO DI ERRORE DELLA
RETROTRASCRITTASI : 1/2000-10000 BASI

• L’accumulo di varianti virali differenti in un


individuo è quindi dovuto a:

 errori della RT polimerasi


 Pressione selettiva dell’immunità umorale e
cellulare
AIDS CONLAMATA

• SVILUPPO DI PATOLOGIE OPPORTUNISTICHE


(virus, batteri, funghi e parassiti)

• SVILUPPO DI NEOPLASIE (sarcoma di Kaposi, linfoma


non-Hodgkin)

• DISORDINI NEUROLOGICI (AIDS dementia


complex: deficit cognitivo, disordini motori e
comportamentali)
TERAPIA (1)

Classi di farmaci approvati dalla FDA:

1. inibitori nucleosidici/nucleotidici della


trascrittasi inversa
2. inibitori non nucleosidici della trascrittasi
inversa
3. inibitori della proteasi
4. inibitori della fusione
TERAPIA (2)
Prima: Monoterapia.
•Uso di una singola classe di inibitori
•Comparsa di ceppi virali farmaco resistenti

Oggi: Highly Active Antiretroviral Treatment (HAART):


combinazione di due o più differenti classi di inibitori

• Diminuzione della carica virale, incremento delle cellule CD4+

• La comparsa di varianti virali con mutazioni è rallentata

• Drammatica diminuzione della mortalità, tempi di sopravvivenza più


lunghi: malattia cronica a lunga decorrenza
Inibitori nucleosidici/nucleotidici della trascrittasi inversa

• ZIDOVUDINA, LAMIVUDINA

• Inibiscono la retrotrascrizione

• Agiscono come terminatori di catena in seguito al loro


inserimento nella catena nascente di DNA provirale
Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa

• Inibiscono la retrotrascrizione

• Si legano direttamente ad un sito specifico della


trascrittasi, alterandone il funzionamento

• NEVIRAPINA
Inibitori della proteasi

• Inibiscono la processazione delle poliproteine del virus


dando luogo a delle particelle virali non infettanti

• NELFINAVIR, SAQUINAVIR, LOPINAVIR

Inibitore della fusione virale

• ENFUVIRTIDE: peptide di 36 aa. che si lega a gp41


impedendo che avvenga la fusione con la membrana della
cellula ospite
EPATITE VIRALE
Epatite: infiammazione del fegato
Epatite virale: causata dai virus dell’epatite, che hanno
come target specifico di replicazione gli epatociti

1.NECROSI di una elevata quantità di epatociti;


riversamento nel sangue di varie sostanze contenute nelle
cellule epatiche, ed in particolare di transaminasi;
se troviamo le transaminasi aumentate nel sangue
potrebbe essere in corso una epatite.

2. INFIAMMAZIONE,
INFIAMMAZIONE afflusso nel fegato di elevata
quantità di cellule infiammatorie (leucociti) richiamate da
un agente nocivo ingrossamento del fegato;
…ma vari altri virus possono causare
epatite

• CMV
• EBV
• HSV
• VZV
• Adenovirus
• Virus della Rosolia
• Virus della Parotite
• Virus delle febbri emorragiche
• Enterovirus (cox e echo)
TIPI DI MALATTIA EPATICA
• Epatite Acuta
•Epatite che guarisce in meno di 6 mesi.

• Epatite Cronica (EC)


•Epatite che si protrae per più di 6 mesi.

• Cirrosi
Progressiva riduzione delle capacità funzionali
dell'organo.

• Carcinoma epatocellulare (HCC)


Tumore maligno primitivo del fegato.     
EPATITE ACUTA
-MARCATO AUMENTO DEGLI INDICI DI NECROSI EPATICA
(transaminasi fino a 2-3.000; v.n. 0- 45).

- QUADRO CLINICO:

-Periodo di incubazione:
incubazione varia in base al tipo di agente virale: 15-50
giorni per l'epatite A, 2 - 6 mesi per l'epatite B, 15 giorni - 4 mesi per
l'epatite C.
•Periodo preitterico:
preitterico presenza di sintomi aspecifici (stanchezza,
mancanza di appetito, nausea, febbre, dolore epatico) Durata: pochi
giorni.
•Periodo itterico:
itterico colorazione giallastra della cute e delle sclere
(ittero) e colorazione scura delle urine (color marsala); scompaiono i
sintomi della fase preitterica. Aumento spiccato delle transaminasi.
Durata variabile da 2 a 4 settimane.
•Periodo di convalescenza:
convalescenza
Guarigione (evoluzione favorevole; progressiva riduzione delle
transaminasi nell’arco di alcuni mesi).
EPATITE FULMINANTE

• È molto rara!
• virus epatitici maggiori (più raramente da HCV)
• infiammazione molto severa
• distruzione quasi completa dell'organo (oltre l'80%)
• rapida compromissione delle fondamentali attività metaboliche del
fegato.
•terapia: trapianto di fegato
EPATITE CRONICA
• Infiammazione permanente del fegato (l’epatite permane per più di 6 mesi)
• Transaminasi costantemente elevate
• Virus epatite B, C e Delta
CIRROSI

• Grado più severo di


compromissione del fegato:
cicatrizzazione di ampie zone
del fegato, fibrosi.
Il fegato sviluppa quindi una
serie di cicatrici che
sostituiscono le cellule epatiche

• Alterazione della struttura


dell'organo e delle sue capacità
funzionali
La cirrosi, a differenza della epatite cronica, è un processo irreversibile
e può essere causa di morte sia per la progressiva riduzione delle
capacità funzionali del fegato sia in quanto favorisce l'insorgenza del
tumore primitivo del fegato (epatocarcinoma).
Virus dell’ Epatite B (HBV)
Epatite B Virus (HBV) (1)
Famiglia: Hepadnaviridae

CARATTERISTICHE GENERALI
• Genoma: molecola di DNA circolare
di 3.2 kb, a doppio filamento
parzialmente incompleto
• virioni: 40nm
• envelope
• presenza di una polimerasi virale con
funzione di trascrittasi inversa
• Tropismo epatico prevalente
Epatite B Virus (HBV) (2)

• HBV è l’unico componente di questa famiglia in


grado di infettare l’uomo
• L’infezione è associata a: epatite acuta,
fulminante, cronica, epatocarcinoma
• Marcata variazione geografica nell’incidenza di
HBV. Fra le regioni endemiche: Asia sud-orientale,
Africa, Medio Oriente
Concentrazione di HBV in vari
fluidi corporei
Bassa/Non
Alta Moderata Rilevabile

sangue liquido seminale urine


siero secrezioni vaginali feci
essudati da ferite saliva sudore
lacrime
latte materno

Tramissione: parenterale, sessuale,


materno-fetale, trapianti
Struttura

• Capside: icosaedro, 200 copie della proteina C (antigene C: HBcAg)


• All’interno del capside: DNA genomico + trascrittasi inversa
• Envelope: 3 glicoproteine (preS1, preS2, S). S è l’antigene di superficie:
HBsAg
Una delle caratteristiche
peculiari dell'HBV e' l'enorme
eccesso con cui vengono
prodotte alcune proteine virali (in
particolare le proteine di
superficie e la forma secretoria
della proteina nucleocapsidica).
L'esubero di sintesi delle
proteine di superficie fa si che
solo una piccola porzione di
esse vengano utilizzate per la
costituzione del rivestimento del
virione, la maggior parte viene
invece secreta sottoforma di
particella (sferica o
filamentosa) difettiva, che non
e' infettiva, in quanto non
contente l'acido nucleico virale.
Ciclo replicativo di HBV

RNA pol II
Patogenesi
• Danno epatico: è principalmente una conseguenza
della risposta immunitaria cellulo-mediata
Fasi di un’infezione acuta da HBV
Tipica Epatite B Acuta
1000 HBsAg
900
IU/L and million copies/ml

800 HBeAg
700
ALT
ALT and HBV DNA

600
500
Symptoms
400
300 HBV DNA
200
100
0
Normal
0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48 60

Months After Exposure


Epatite fulminante

Nell’1-2% dei casi sintomatici acuti, il paziente può andare


incontro ad epatite fulminante:

• Necrosi epatica molto più estesa


• Quadro clinico drammatico con possibile evoluzione in
insufficienza renale e coma
• Letale nell’8% dei casi
• Cause: infezioni con ceppi di HBV molto virulenti, co-infezione
con HDV o un altro virus dell’epatite, risposta immunitaria
incontrollata da parte del paziente
Infezione cronica

• Un tempo esisteva la distinzione fra epatite cronica attiva e epatite


cronica persistente
• Oggi si distingue fra epatite cronica minima ed epatite cronica grave (con
progressione e frequente evoluzione a cirrosi e HCC)
Carcinoma primitivo del fegato

• Nei pazienti con infezione persistente da HBV, il


rischio di sviluppare un carcinoma primitivo del
fegato è circa 200 volte più elevato che nei soggetti
non infetti

• Il legame molecolare fra oncogenesi e infezione da


HBV è poco chiaro

• Alcune ipotesi: possibilità di integrazione del genoma


virale nel genoma della cellula ospite, ruolo della
proteina X di HBV
Tipica Epatite B Cronica
HBsAg
800
HBeAg
IU/L or million copies/ml

700
600
ALT and HBV DNA

500
400 HBV DNA
300
200 ALT
100
0 Normal
0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48 60

Months After Exposure


• Trattamento:
Farmaci immunomodulatori: per stimolare il riconoscimento da parte del sistema
immunitario degli antigeni virali. Interferon
Analoghi nucleosidici della trascrittasi inversa

• Prevenzione

Immunoprofilassi attiva: vaccino contro l'HBV, costituito da particelle di HBsAg


preparate artificialmente con la tecnica del DNA ricombinante (ingegneria genetica).
Dal 1991 la vaccinazione è obbligatoria in Italia per tutti i nuovi nati e per i bambini al
12° anno di età e viene particolarmente consigliata alle persone a rischio (conviventi dei
portatori ed operatori sanitari).
Immunoprofilassi passiva: in caso di esposizione accidentale (es. puntura accidentale
con ago contaminato) è possibile somministrare immunoglobuline umane specifiche
contro l'HBV, entro 2-4 ore dall'esposizione. La protezione fornita ha una durata di 2-3
settimane.
Vaccinazione anti epatite B.

Ciclo vaccinale iniziale:


- 1^ dose: tempo 0
- 2^ dose: dopo 1 mese
- 3^ dose: dopo 6 mesi
Richiami:
- ogni 4-5 anni, previo controllo del titolo anticorpale
Protezione:
- il vaccino risulta efficace in oltre il 90% dei casi;
- l'efficacia viene dimostrata con la presenza di anticorpi
protettivi (HBsAb) alla fine del ciclo vaccinale.
VIRUS DELL’EPATITE D (DELTA)
(HDV)

• Non appartiene ad alcuna


famiglia di virus animali
• genoma: RNA circolare a
filamento singolo, complessato
con la proteina antigene delta
• envelope contenente HBsAg,
derivante da HBV

È quindi necessaria la presenza di


HBV!
Trasmissione e Sintomi HDV

• HDV è trasmesso con le stesse modalità di HBV


(però trasmissione sessuale è meno frequente)

Il danno epatico è sostanzialmente simile a quello


prodotto nelle altre epatiti:
• Ittero
• Urine scure
• Crampi addominali
HDV – Prevenzione e
trattamento
 Non è disponibile alcun trattamento specifico per HDV

 Dato che HDV dipende dalla coinfezione con HBV per


la sua replicazione, i metodi utilizzati per la
prevenzione dell’infezione da HBV sono efficaci anche
nel prevenire quella da HDV

 Non esiste un vaccino, quindi gli individui con infezione


cronica da HBV possono essere protetti da HDV
unicamente limitando la possibilità di esposizione