IDENTIFICACIN

MICROBIANA.
mediante mtodos
basados en sistema de
utilizacin de sustratos,
inmunoensayos y deteccin
molecular.
Durante su ejercicio profesional, es muy
importante que el farmacutico conozca el
fundamento de los mtodos existentes para la
identificacin microbiana
Se entiende por identificacin microbiana al
conjunto de tcnicas y procedimientos que se
aplican para establecer la identidad de un
microorganismo. Estas tcnicas se utilizan en
diferentes reas, por ejemplo:

En el rea clnica donde es de capital importancia
conocer cul es el agente causal de la infeccin
que presenta un paciente, de manera de poder
tratarlo con agentes teraputicos.
En la industria farmacutica, cosmtica y de
alimentos donde las normas de control de calidad
exigen la ausencia de ciertos microorganismos.
En investigacin bsica donde se asla un
determinado Microorganismo que debe
identificarse para comprobar si se trata de un
microorganismo conocido o de uno nuevo para
poder clasificarlo.
MUESTRA ANLISIS MICROSCPICO DAPI : Nmero total de microorganismos
FISH : Nmero total y grupos de bacterias
activas
CULTIVO en medios adecuados (R2A, etc)
IDENTIFICACIN
Morfolgica
Bioqumica
Molecular
Bacterias cultivables
ANLISIS POR CIDOS NUCLEICOS
EXTRACCIN DNA
EXTRACCIN RNA
DGGE
Clonacin DNA16S y
Secuenciacin
IDENTIFICACIN
Bacterias presentes
RT-PCR Clonacin y
Secuenciacin
IDENTIFICACIN
Bacterias activas
EJEMPLO DE ANALISIS DE COMUNIDADES MICROBIANAS
CLASIFICACIN DE LOS MTODOS DE
IDENTIFICACIN MICROBIANA

Los mtodos ms utilizados para la
identificacin microbiana, los podemos clasificar
en:
1. Mtodos basados en criterios morfolgicos.
2. Mtodos basados en tincin diferencial
3. Mtodos basados en pruebas bioqumicas
4. Mtodos basados en tipificacin con fagos
5. Mtodos basados en pruebas serolgicas
6. Mtodos basados en deteccin molecular
Mtodos basados en criterios
morfolgicos
Los rasgos morfolgicos
(estructurales) han
ayudado a los
taxonomistas por muchos
aos a clasificar
organismos
estos microorganismos
que se ven tan parecidos
bajo un microscopio,
pueden diferir en
propiedades bioqumicas,
fisiolgicas y/o
serolgicas
Por ejemplo: la
presencia de endosporas y su
localizacin resulta de mucha
utilidad en la identificacin de bacilos
esporulados.
Mtodos basados en tincin
diferencial
La mayor parte de las
bacterias, teidas con
Gram, las podemos
clasificar como gram
positivas o gram
Negativas, otras tinciones
diferenciales, como la
cido resistente, se
aplican a otro tipo de
bacterias, como por
Ejemplo micobacterias.
Mtodos basados en pruebas
bioqumicas
Estas pruebas se
fundamentan en
demostrar si el
microorganismo es capaz
de fermentar azcares, la
presencia de enzimas, la
degradacin de
compuestos, la
produccin de
compuestos coloreados,
etc.
Gram positivos
Lisostafina
- Coagulasa
- DNAsa
- Fosfatasa
- CAMP
- Hidrlisis de esculina
- Hidrlisis del hipurato
- Sensibilidad a novobiocina
- Sensibilidad a optoquina
- Sensibilidad a bacitracina
- Sensibilidad a SXT
- Crecimiento en ClNa
- Crecimiento en bilis
- Produccin de hemlisis
- Pruebas inmunolgicas
Gram negativos
galactosidasa (ONPG)
- Arginina dehidrolasa
- Lisina y ornitina decarboxilasa
- Utilizacin de citrato
- Produccin de SH2
- Produccin de indol
- Ureasa
- Triptfano desaminasa (TDA)
- Reduccin de nitratos
- Rojo de metilo
- Voges Proskauer
- Kligler
- Hidrlisis de la gelatina
- Pruebas inmunolgicas
Mtodos basados en tipificacin
con fagos
La interaccin entre un
virus bacteriano (fago) y
su clula bacteriana
sensible es sumamente
especfica, ya que el
proceso de adsorcin se
encuentra mediado por
receptores especficos
tanto en el virus como en
la clula bacteriana.
El uso de fagos especficos permite identificar y
subclasificar bacterias dentro de una misma
especie.
Mtodos basados en ensayos
serolgicos
Los mtodos serolgicos,
implican la utilizacin de
preparaciones de
inmunoglobulinas especficas
provenientes del suero o de un
reactivo, y que pueden ser de
gran utilidad en la
identificacin microbiana en
muestras puras o en muestras
biolgicas.
Cada uno de los mtodos
tiene su fundamento particular,
pero en lneas generales,
todos se basan en la reaccin
de un antgeno presente en el
agente microbiano con su
anticuerpo especifico.
Mtodos basados en biologa
molecular
mtodos basados en biologa
molecular donde, a travs de
procedimientos y reactivos, se
pueden detectar determinadas
secuencias de ADN que son
propias de un determinado
agente microbiano.
El mtodo que se est
utilizando ampliamente en los
laboratorios de diagnstico es
el PCR (Polymerase Chain
Reaction), que se aplica
generalmente para la
identificacin de
microorganismos que no
pueden ser cultivados por los
mtodos convencionales.
Desnaturalizacin , hibridacin
:Unin del cebador ,extensin: sntesis
Pruebas de identificacin
iniciales:
Morfologa bacteriana
Tincin de Gram
Agrupamiento celular
Movilidad
Atmsfera de
crecimiento
Catalasa
Citocromo - oxidasa
Oxidacin -
fermentacin
Fermentacin de
azcares
Identificacin de E. coli
E. coli. AGAR BRILA
E. coli. AGAR MAC CONKEY
IMVIC
I tests for the production
of indole from tryptophan.
M tests for acid from
glucose, methyl red test.
V tests for acetoin from
glucose, Voges-
Proskauer test.
C tests for utilization of
citrate as the sole carbon
source.
Positive reactions are
shown in the top row.
salmonella
Salmonella sp. after 24 hours
growth on XLD agar. Xylose
Lysine (XL) agar is used
when trying to culture and
isolate Gram-negative
enteric bacilli. When XL agar
is supplemented with
sodium thiosulfate, ferric
ammonium citrate, and
sodium deoxycholate, it is
then termed XLD agar, and is
then an even more selective
medium than XL alone. The
presence of any black
colored area indicates the
deposition of hydrogen
sulfide, (H2S) under alkaline
conditions. (CDC)

Las colonias
sospechosas de
Shigella crecidas en Agar
Salmonella-Shigella son
transparentes,
translcidas u opacas y
suelen ser lisas. En este
medio las colonias de
otros microorganismos
que fermentan la lactosa
(coliformes) son colonias
rojizas y en muchos
casos mucoides.
Las colonias sospechosas de
Shigella en Agar MacConkey
son incoloras y transparentes.
En este medio las colonias de
otros microorganismos que
fermentan la lactosa
(coliformes) son colonias
rojizas.
Las colonias
sospechosas de Shigella
crecidas sobre Agar Xilosa
Lisina Desoxicolato (XLD)
son transparentes y del
mismo color que el medio
de cultivo (rojo).

Este gnero bacteriano al
no fermentar la xilosa, la
lactosa ni la sacarosa, no
da lugar a que vire a
amarillo el rojo fenol.
Como tampoco
decarboxilan la lisina, no
se produce color rojo
prpura alrededor de las
colonias, al no haberse
producido cadaverina.
Shigella da la siguiente reaccin sobre TSI:

- Alcalina (rojo) en la superficie inclinada.

- cida (amarillo) en el fondo.

- Sin produccin de SH2 (sin ennegrecimiento del fondo del tubo).
Shigella da la siguiente reaccin sobre LIA:

- Alcalina (color prpura) en la superficie inclinada.

- cida (amarillo) en el fondo.

- Sin Produccin de SH2 (ennegrecimiento del fondo del tubo).
Las Shigella no son capaces de utilizar urea.


El medio urea contiene un indicador de pH que vira a
color rosa fuerte cuando la reaccin es positiva.

La reaccin debe ser negativa: urea (-).
Permanece el mismo color que antes de la incubacin
A partir de los tubos positivos de TSI o LIA, sembrar una galera
de identificacin bioqumica partiendo de los cultivos
seleccionados.