TESTES USADOS EM

DIAGNSTICO E TITULAO
VIRAL
Mtodos de Deteco Viral
1) Buscar o Vrus
O vrus propriamente
Protenas Virais
Efeitos virais in vitro
Genoma Viral


1 Investigao Direta
(buscar o vrus)
Microscopia Eletrnica morfologia viral

Deteco do vrus (antgeno) IFA, ELISA, AGLUTINAO,
etc
Deteco do Genoma Viral Hibridizao molecular
Amplificao gnica (PCR ou
derivados)

Tecidos e/ou matrizes
onde se pode buscar o vrus

Aspirato Nasofaringeal Vrus Respiratrio sincicial
Influenza A and B
Parainfluenza
Adenovirus
Fezes Rotavirus
Adenovirus
Astrovirus
Norovirus, etc
Fluidos Herpes Simples
HIV
Esfregaos HPV, HIV

Bipsias HIV, EBV, et

Microscopia Electrnica
10
6
partculas virais/mL so necessrias para visualizao.

Exemplos:

Fezes Rotavirus, Adenovirus,
Norovrus
Astrovirus, Calicivirus

Mucosas .Papilomavirus (HPV)
Eletromicrografias
Adenovirus
Rotavirus Herpes Simples
Raiva
Astrovrus
HIV
Imuno Microscopia Eletrnica (IME)
A sensibilidade e a especificidade da ME pode ser aumentada por
associao a tcnicas imunolgicas.

Existem duas variantes:

Microscopia Eletrnica Imune Clssica (MEI) - A amostra
tratada com anti-soros especficos antes de ser analisadas no ME.
Partculas virais aglutinadas

Microscopia Eletrnica de Fase Slida (MEIFS) - uma grade
revestida com anticorpos especficos anti-soros colocada em
contato com a amostra. Partculas virais sero absorvidas na grade
- pelo anticorpo.
Problemas com a Microscopia Eletrnica
Equipamentos e manuteno custos elevados

Requer bastante experincia do observador

Passiva de falsos negativos/baixa sensibilidade
(depende da origem amostral)
BUSCAR AS
PROTENAS VIRAIS
Testes Imunolgicos: ELISA,
IMUNOHISTOQUMICA,
IMUNOFLUORESCNCIA
CITOMETRIA DE FLUXO
RADIOIMUNOENSAIO

ELISA - Ensaio Imunoenzimtico
O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois
conjugados com enzimas.


O produto final corado surge por ao da enzima que converte um
substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado
pela enzima induz mudana de cor de uma substncia indicadora).

A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, feito atravs de
leitura em fotocolormetro.
IMUNOHISTOQUMICA: deteco de
clulas infectadas em cortes
histolgicos (EBV, HPV)
Clula infectada por Rotavrus Smio
Citometria de Fluxo
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
RADIOIMUNOENSAIO (RIA): triagem
do vrus da hepatite B em doadores de sangue
Investigao Indireta
(buscar o efeito do vrus; isolar o
vrus; atenuar o vrus)
Cultura celular ou ovos embrionados: Efeito citoptico
(CPE) ou infeco do embrio


Uso de Animais: Estudo da doena e/ou morte

Como isolar vrus?
- a partir dos tecidos infectados (limitado)
- clulas em cultura
- ovos embrionados
CULTURA CELULAR

1. Cultivo celular primrio (derivado do tecido)

2. Cultivo em linhagens celulares semi-contnuas (Ex:
fibroblastos de rins de macaco)

3. Cultivo em linhagens celulares contnuas (tumorais) - HeLa,
Vero, Hep2, A549

Todos os vrus podem
ser cultivados in vitro?
Vrus que podem ser facilmente
cultivveis

Vrus difceis de cultivar Vrus Fastidiosos
Herpes Simples Varicella-Zoster Norovirus
Vrus das Hepatites
Adenovrus Entricos
Rotavrus
Citomegalovirus Sarampo
Adenovirus (exceos entricos) Rubeola
Poliovirus Rinovirus
Coxsackie B virus Coxsackie A viruses
Ecovirus
Influenza
Parainfluenza
Caxumba
Virus Respiratrio Sincicial


Linhagens Celulares Visualizao de Efeito Citoptico
Controle Celular
Controle Viral (PV)
Amostra ambiental
Positiva para Enterovrus (7 dias)
Amostra ambiental
Positiva para Enterovrus (4 dias)
Efeitos citopticos clssicos
ATENUAO DE VRUS PARA
PRODUO DE VACINAS
Ensaio de Formao de Placa de Lise
(Contagem em PFU)
1- Diluies Seriadas
2- Infeco Celular
Quantificao Viral em cultura celular
Ensaio de Formao de Placa de Lise
(Contagem em PFU)
1- Diluies Seriadas
2- Infeco Celular
Quantificao Viral em cultura celular
Desafios em Cultivos Celulares
s vezes requerem longos perodos e mais de uma passagem para
obter resultados
A matriz de onde provm a fonte viral pode ser um obstculo
(sangue, amostras ambientais, mucosas, fezes)
Suceptvel a contaminaes bacterianas e fngicas
Suceptvel a substncias txicas presentes na amostra
Muitos vrus no so adaptados ao cutivo celular in vitro (hepatites,
diarrias, papilomavrus)

Cultivo de Vrus em Ovos Embrionados
Isolamento Viral Inoculaes em Ovos Embrionados
Cultivo Celular para Isolamento e Viabilidade Viral - Vrus da Bronquite Aviria
Passagem 1
Passagem 2
Passagem 3
Passagem 4
27
Teste rpido, fcil e barato

Pode ser utilizado para detectar anticorpos para
o vrus ou inibio da hemaglutinao

Mede quantidade total de vrus (no somente
vrus infecciosos)
Testes de Hemaglutinao
28
Testes de
Hemaglutinao

Alguns vrus, ou antgenos derivados de vrus, se adsorvem s hemcias
atravs de receptores existentes na membrana destas.

Como resultado, as hemcias aglutinam, sendo este fenmeno denominado
de hemaglutinao.
Vrus de influenza: aglutina hemcias de galinha, cobaia, carneiro e humanas do
grupo O.
Vrus do Sarampo: Aglutinam hemcias de macaco.
Vrus do Dengue: Aglutinam hemcias de ganso

As hemaglutininas de vrus respiratrios so
antignicas e, quando um vrus infecta o organismo
humano ou animal, alm de anticorpos neutralizantes,
h a produo de anticorpos especficos contra as
hemaglutininas virais. Esses anticorpos presentes no
soro so capazes de se combinar com o vrus in vitro,
inibindo assim a hemaglutinao. Este o princpio da
reao de inibio da hemaglutinao, que tem grande
utilidade no diagnstico dessas infeces virais.
TESTES DE INIBIO
DA HEMAGLUTINAO
Buscar o genoma viral
Utiliza tcnicas que identificam e/ou quantificam o
genoma viral
AMPLIFICAO GNICA
HIBRIDIZAES MOLECULARES
Mtodos Moleculares
Mtodos baseados na deteco de genoma
viral, conhecido como moleculares, so muito
utilizados.

PCR
Dot-blot
Southern blot


A especificidade depende das condies da reao (otimizao)




Mais utilizada!
Busca PubMed: 20.163 publicados
(ltimos 8 nos)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?termpcrdiagnosisviral (Acesso em 12.03.2012)
Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
Amplifica a sequncia alvo de DNA/cDNA, permitindo detectar o genoma viral
buscado.
baseada em uma reao enzimtica com uso de oligonucleotdeos que flanqueiam a
sequncia alvo que ser aplificada pela ao da enzima DNA Polimerase.
Graas a Taq Polimerase, enzima termoestvel, a reao possivel em um nico MIX
de reagentes;
Ciclos repetidos (usualmente 25 40 ciclos) de desnaturao do DNA (94
o
C),
anelamento dos oligos / primers (50
o
C 65C) e extenso dos primers (72
o
C)
resultam em uma produo exponencial do fragmento expecfico;
Atualmente a qPCR est sendo amplamente utilizada Permite
quantificar em cpias genmicas o fragmento detectvel.
Esquema de PCR
VDEO PCR
Os iniciadores procuram
o molde na molcula
de DNA, sequncias que
lhes so
complementares
O pareamento dos iniciadores
com a sequncia que lhe
complementar j est bem
facilitada, pois j existem vrias
cpias das sequncias alvos.

A amplificao j sub-
tima devido limitao
dos reagentes -
competio dos
produtos gerados com
os iniciadores

Reao em Cadeia da Polimerase
Vantagens da PCR
- Altamente sensvel (pequena quantidade de material gentico requerido)
- Rpida
Desvantagens of PCR
Passiva de contaminaes
Alto treinamento do manipulador
Se PCR qualitativa (Resultado no quantifica)
No acessa a infecciosidade viral
Relativamente custosa (25 Reais/reao)
qPCR
HIBRIDIZAES
MOLECULARES
Deteco de EBV em
corte histolgico de
linfonodo com doena
linfoproliferativa
ps-transplante.
Deteco de EBV em
corte histolgico de
linfonodo com
linfoma de Hodgkin.
Deteco de HPV por FISH
(HIBRIDIZAO FLUORESCENTE)
Mtodos de Deteco Viral
2) Buscar a resposta ao vrus


Investigao sorolgica
(buscar a resposta imune ao vrus)
Deteco de de anticorpos presentes no soro
nas fases aguda (IgM) e/ou convalescente
da infeco (IgG ou IgA).
ELISA
WESTERN BLOT
CITOMETRIA DE FLUXO
IMUNOFLUORESCNCIA
Sorologia
Diagnosticando Infeces Primrias:
- Pelo aumento de IgG e/ou IgA (dependendo do alvo do vrus)
- Presena de IgM no soro indicando infeco primria
- Soroconverso

Diagnosticando Reinfeces ou Infeces secundrias
-IgG ou IgA (dependendo do alvo do vrus) no soro e/ou
fluidos corpreos
Perfil Sorolgico das Infeces Virais
ELISA Ex: Teste para HIV
Western Blot
Eletroforese de
protenas.
Identifica antgenos
ou anticorpos.
Western Blot
HIV-1 Western Blot
Linha 1: Controle Positivo
Linha 2: Controle Negativo
A: Negativo
B: Indeterminado
C: Positivo
Utilidade dos Resultados por Sorologia
Resposta especfica ao vrus.

Em caso de doenas assintomticas a deteco
sorolgica (IgM e IgG) indica doena.

Existem vrus que produzem efeitos clnicos aps
soroconverso (HIV, RAIVA).


Problemas com Sorologia
Requer longos perodos para diagnosticar a
infeco.

Possibilidades de resultados falsos positivos
(imunocomprometidos).