INGENIERIA GENETICA

1.-INTRODUCCIN
La utilizacin de organismos vivos o de sus componentes en la
obtencin de productos tiles para las personas es la base de la
biotecnologa .Tradicionalmente se utilizaba la fermentacin de
microorganismos para obtener productos como el yogur, el pan o el
vino
El paso de la biologa tradicional a la moderna surge con las
tcnicas que derivan de la ingeniera gentica como la tecnologa
del ADN recombinante
La ingeniera gentica puede definirse como un conjunto de
tcnicas, nacidas de la Biologa molecular, que permiten manipular
el genoma de un ser vivo.
La ingeniera gentica es una tcnica que consiste en la
manipulacin, modificacin e introduccin de genes en el genoma
de un individuo que carece de ellos.

Los organismos que han sido modificados por ingeniera gentica se
denominan transgnicos
La ingeniera gentica incluye un conjunto de tcnicas biotecnolgicas,
entre las que destacan:

1.-la tecnologa del ADN recombinante: con la que es posible aislar y
manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en
otro.
Se realiza a travs de las enzimas de restriccin que son capaces de
"cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN
recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN
extrao un un ADN receptor. Por ejemplo, la integracin de un ADN
vrico en un ADN celular.

2.- Clonacin Permite la produccin de mltiples copias de un gen
especfico o de un fragmento de ADN


3.-La secuenciacin del ADN: Tcnica que permite
saber el orden o secuencia de los nucletidos que forman
parte de un gen.

4.- la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR): con
la que se consigue aumentar el nmero de copias de un
fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una
mnima cantidad de muestra de ADN, se puede
conseguir toda la que se necesite para un determinado
estudio.
.


El conocimiento del genoma de muchos organismos ha provocado la
aparicin de nuevas disciplina cientficas:
-genmica: rama de la gentica que estudia el genoma completo de un
organismo
-Protemica: Estudia, desde el punto de vista estructural y funcional,
todas las protenas codificadas por un genoma concreto
-Farmacogentica: Persigue la fabricacin de medicamentos
personalizados
2.- TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINNANTE
Esta tecnologa nos permite obtener fragmentos de ADN en
cantidades ilimitadas, que llevar adems el gen o los genes que se
desee :
.

Este ADN puede incorporarse a las clulas de
otros organismos (vegetales, animales,
bacterias...) en los que se podr "expresar" la
informacin de dichos genes. (De una manera
muy simple podemos decir que "cortamos"
un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de
una bacteria; si por ejemplo es el gen que
regula la fabricacin de insulina, lo que
haramos al ponrselo a una bacteria es
"obligar" a sta a que fabrique la insulina).

Lo primero que hay que realizar es un corte especfico del ADN
en fragmentos pequeos y manejables mediante la utilizacin de
un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restriccin que
pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas
se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres,
siendo lo caracterstico de ellas estos dos principios:


a) Cada enzima de restriccin reconoce una secuencia especfica
de nucletidos(4-8 nucletidos denominado sitio de restriccin) y
corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN


b) Los extremos libres que quedan se
llaman extremos pegajosos, porque
pueden unirse a otros fragmentos de
ADN que hayan sido cortados por la
misma enzima de restriccin


Estas uniones entre los bordes cohesivos son temporales , pero se
pueden hacer permanentes en presencia de la enzima ADN ligasa
La unin del ADN procedente de dos orgenes distintos produce
una molcula de ADN recombinante
Los fragmentos obtenidos despus de la actuacin de las distintas
enzimas de restriccin, se pueden separar por tamaos, es decir,
segn el nmero de pares de nucletidos que llevan, mediante la
tcnica de electroforesis y as estudiar los distintos trozos.
Segn donde se hallen las secuencias
de reconocimiento, un gen
determinado puede estar
fragmentado en varios trozos, o bien
un trozo puede contener varios
genes, posibilidades que hay que
confirmar.

El segundo paso es la insercin de los fragmentos de ADN. Esta
insercin se realiza en vectores de clonacin, que son los agentes
transportadores capaces de introducirlos en las clulas
hospedadoras.

Los vectores de clonacin son pequeas molculas de ADN
capaces de transportar ADN extrao , que tienen capacidad para
autorreplicarse dentro de las clulas hospedadoras.

Adems del origen de
replicacin, los vectores de
clonacin deben llevar otros
genes denominados marcadores,
que sirven para identificar las
clulas que contienen el vector
de clonacin.

Se suelen utilizar como marcadores,
Genes de resistencia a antibiticos. Sirven para identificar
bacterias que contienen el vector de clonacin, porque estas
bacterias sern resistentes al antibitico del gen marcador.

Genes de luminiscencia.. En este caso, la clula que contenga el
gen que se quiere clonar, tendr la propiedad de emitir luz, ya que
el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa
caracterstica. Este sistema se emplea cuando la clula
hospedadora es una clula eucariota.


Los vectores de clonacin ms utilizados
a) Plsmidos. Son molculas de ADN circular bacteriano, con
un tamao menor que el del cromosoma. Se replican con
independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio
origen de replicacin.

La unin del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el
vector de clonacin, se realiza por medio ADN-ligasas, que unen
ambos trozos de ADN
.b) Virus bacterifagos. El proceso es similar, se trata de insertar el
gen deseado en un fragmento de ADN vrico Posteriormente se
ensamblarn las distintas partes del virus As quedar el virus
completo. En el siguiente paso se insertar este ADN por el proceso
de la TRANSDUCCION: proceso en el cual los bacterifagos
transportan genes bacterianos desde una clula husped a otra

Son capaces de llevar mayor cantidad de ADN que un plsmido

c) Csmidos: son vectores
hbridos entre el fago y un
plsmido , de modo que su
ADN puede replicarse como
un plsmido o empaquetarse
como un fago
D) Otros vectores: Cromosomas artificiales de levaduras, genomas
modificados de adenovirus, retrovirus, cromosomas humanos
artificiales.

El siguiente paso ser introducir el vector de clonacin que
contiene el gen que se quiere clonar en la clula hospedadora,
para que sta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve
el gen concreto.

Existen varios mtodos que dependern del tipo de clula
fundamentalmente.
En bacterias (clulas procariotas), mediante estos procesos:
a) Transformacin. Ocurre espontneamente en ciertos tipos de
bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la clula
bacteriana a tratamientos fsicos y qumicos.
La clula capta molculas de ADN que se encuentran en el medio
externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma.

b) Transduccin. Este mtodo consiste en introducir el ADN en la
clula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de
clonacin el genoma del virus.

Para poder realizar la clonacin gnica, el husped debe ser:
- De crecimiento rpido y en un medio de cultivo barato
- No ser daino ni patgeno
- Ser capaz de aceptar ADN exgeno
- Tener las enzimas necesarias para la replicacin del vector
Los huspedes ms utilizados son las bacterias Escherichia coli
(Bacillus subtilis y la levadura Saccharomyces cerevisae
. Una vez que se ha conseguido la poblacin de bacterias
transformadas, el siguiente paso es poner a las bacterias en un
medio de cultivo apropiado para que se multipliquen. A la vez que
se reproducen las bacterias lo hace tambin el plsmido con el gen
que interesa, el resultado es que se obtiene un clon de clulas que
llevan todas ese gen de inters.
Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de inters
para el hombre. Este conjunto de clones se denomina biblioteca
genmica


3.- REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Es una tcnica que permite duplicar un nmero ilimitado de veces un
fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta tcnica
pueden generarse millones de molculas idnticas, a partir de una
molcula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas.

La reaccin es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muy
pequeas y slo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una
fuente de calor y unas pequeas cadena de nucletidos que actan
como cebadores.

La reaccin es un proceso cclico:
a) La molcula de ADN que va a copiarse se calienta para
que se desnaturalice y se separe las dos hebras.

Las cadenas recin
formadas son
separadas de nuevo
por el calor y
comienza otro nuevo
ciclo de copias. Estos
ciclos se repiten hasta
que se obtiene el
nmero de copias
deseado

b) Se enfra la mezcla para permitir que los cebadores se unan a cada uno
de los extremos de las hebras del ADN
c) Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza
la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales,
Thermus aquaticus, as la enzima puede trabajar a altas temperaturas).

APLICACIONES DE LA PCR
Secuenciacin
Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la
formacin de suficiente cantidad de ADN molde para su
secuenciacin. Es mucho mas sencillo y rpido que la
clonacin en clulas.

Estudios evolutivos
Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos
ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos.
Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de
organismos actuales y poder reconstruir rboles filogenticos.
El PCR tambin se ha utilizado para conseguir el mapa del
genoma humano.
Huellas dactilares del ADN.
Mediante esta tcnica es posible comparar muestras
diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo
individuo o no, o si existe parentesco entre ellas.
Esta tcnica se aplica actualmente en Medicina forense e
investigaciones policiales, con el fin de identificar
individuos a partir de muestras biolgicas, como sangre,
semen, piel o cabellos. Tambin se utiliza en las pruebas de
paternidad.
Diagnsticos prenatales: Utilizando ADN de clulas
embrionarias

4.- SECUENCIACION DEL ADN
Se realiza con el mtodo didesoxi de Sanger o Mtodo de
terminacin de la cadena
Se denomina as porque es necesaria la utilizacin de los
didesoxirribonucletidos que son nucletidos modificados que
han perdido el grupo OH situado en el carbono 3y que provocan
la parada de la copia del ADN por la ADN polimerasa
Para obtener la secuencia de
bases nitrogenadas de un
segmento de ADN por el
mtodo enzimtico de
terminacin de cadena, se
necesitan los siguientes
compuestos:
El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar.
Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN
Polimerasa I del bacteriofago T4.
Un cebador o "primer"
Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A
Por ltimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP,
ddCTP y ddGTP) marcados con una molcula fluorescente para
cada uno de ellos
El mtodo bsicamente consiste en:
1 Se desnaturaliza el ADN que se desea secuenciar

2 Se mezclan todos los componentes de la reaccin y se forman
nuevas cadenas de ADN que utilizan como molde la secuencia del
ADN que se quiere secuenciar . La copia continua hasta que por
azar se encuentra con un didesoxi. Al final se obtiene una mezcla
de cadenas de ADN de longitudes variadas

3.- Se separan las cadenas marcadas cuando la mezcla atraviesa un
gel de poliacrilamina, de tal manera que las ms cortas se mueven
con mayor rapidez
4.- Se obtiene un espectrograma que nos dar la secuencia de bases
complementaria de la molde
5.- APLICACIONES MEDICAS DE LA INGENIERIA
GENETICA
1.-OBTENCIN DE PROTEINAS DE MAMFEROS
Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del
crecimiento, factores de coagulacin, etc ... tienen un inters
mdico y comercial muy grande. Antes, la obtencin de estas
protenas se realizaba mediante su extraccin directa a partir
de tejidos o fluidos corporales.

En la actualidad, gracias a la tecnologa del ADN
recombinante, se clonan los genes de ciertas protenas
humanas en microorganismos adecuados para su fabricacin
comercial.

Un ejemplo tpico es la produccin de insulina que se obtiene
a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se
clona el gen de la insulina humana.

OBTENCIN DE VACUNAS RECOMBINANTES
El sistema tradicional de obtencin de vacunas a partir de
microorganismos patgenos inactivos, puede comportar un riesgo
potencial.
Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen
actualmente por ingeniera gentica. Como la mayora de los
factores antignicos son protenas lo que se hace es clonar el gen
de la protena correspondiente.

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES DE ORIGEN GENTICO:
Conociendo la secuencia de nucletidos de un gen responsable de
una cierta anomala, se puede diagnosticar si este gen anmalo est
presente en un determinado individuo.
OBTENCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES.
(TERAPIA GNICA)
Este proceso abre las puertas para luchar contra enfermedades
como el cncer y diagnosticarlo incluso antes de que
aparezcan los primeros sntomas

La terapia gnica se define como tcnica teraputica mediante la
cual se inserta un gen funcional en las clulas de un paciente
humano para corregir un defecto gentico o para dotar a las
clulas de una nueva funcin
6.- APLICACIONES EN LA AGRICULTURA
Mediante la ingeniera gentica han podido modificarse las
caractersticas de gran cantidad de plantas para hacerlas ms
tiles al hombre, son las llamadas plantas transgnicas. Las
primeras plantas obtenidas mediante estas tcnicas fueron un
tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas
semanas despus de haber sido cosechados.
Recordando que la clula vegetal posee una rgida pared celular,
lo primero que hay que hacer es obtener protoplastos (los
protoplastos son clulas desprovistas de pared celular, que se
consigue empleando enzimas que destruyen la lmina media y
desorganizan la parte de celulosa).
PLANTAS TRANSGNICAS
Entre los principales caracteres que se han transferido a
vegetales, merecen destacarse:
Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades
microbianas.
Ya se dispone de semillas de algodn, que son insensibles a
herbicidas. Para la resistencia a los insectos se utilizan cepas de
Bacillus thuringiensis que producen una toxina (toxina - Bt)
daina para las larvas de muchos insectos, de modo que no
pueden desarrollarse sobre las plantas transgnicas con este
gen. Respecto a los virus se ha demostrado que las plantas
transgnicas con el gen de la proteina de la cpsida de un virus,
son resistentes a la invasin de dicho virus.
Incremento del rendimiento fotosinttico
Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosinttica de
plantas C
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que es ms eficiente.
Mejora en la calidad de los productos agrcolas
Tal es el caso de la colza y la soja transgnicas que producen
aceites modificados, que no contienen los caracteres
indeseables de las plantas comunes.
Sntesis de productos de inters comercial
Existen ya plantas transgnicas que producen anticuerpos
animales, interfern, e incluso elementos de un polister destinado
a la fabricacin de plsticos biodegradables



Asimilacin de nitrgeno atmosfrico
Aunque no hay resultados, se ensaya la
transfeccin del gen nif responsable de la
nitrogenasa, existente en
microorganismos fijadores de nitrgeno, y
que permitira a las plantas que
hospedasen dicho gen, crecer sin
necesidad de nitratos o abonos
nitrogenados, aumentando la sntesis de
proteinas de modo espectacular.

7.-APLICACIONES EN ANIMALES
La transgnesis se puede definir como la introduccin de ADN extrao
en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y
afecte a todas las clulas en los organismos multicelulares.
Generalmente, en animales, el ADN extrao, llamado transgen, se
introduce en zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADN
extrao en su genoma, previamente a la primera divisin , producirn
un organismo transgnico; de modo que el transgn pasar a las
siguientes generaciones a travs de la linea germinal (gametos).
Entre las aplicaciones de los animales transgnicos se pueden destacar:
La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo
embrionario y su regulacin.
Manipular de forma especfica la expresin gnica in vivo.
Estudiar la funcin de genes especficos.

Poder utilizar a mamferos como biorreactores para la
produccin de proteinas humanas.
La correccin de errores innatos de metabolismo mediante
terapia gnica.
El principio de la clonacin est en la obtencin de organismos
idnticos genticamente, y por tanto morfolgica y fisiolgicamente,
como lo son dos gemelos univitelinos. Esto ha sido el sueo de muchos
ganaderos, que han deseado que todo su ganado tuviera las cualidades
de algn ejemplar especialmente bueno.
Se pueden utilizar dos mtodos para conseguir clones de animales:
Por disgregacin de clulas embrionarias .Se basa en el mismo
principio por el que nacen gemelos de forma natural.Se pueden separar
las clulas de un embrin en diferentes estados de desarrollo, desde el
estado de 2 clulas hasta el estado de mrula. Cada clula separada
puede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse para dar un
individuo completo.





Por TRANSFERENCIA
NUCLEAR. Se toman
clulas embrionarias en fase
de mrula o blstula,
obtenidas por disgregacin,
se cultivan in vitro,y
despus se transfieren a
ovocitos a los que se les ha
quitado el ncleo.
Se provoca la fusin de las
dos clulas animales de
modo que el ncleo de la
clula embrionaria quede en
el interior del ovocito,
pudiendo ste empezar a
funcionar como un zigoto.

8.-APLICACIONES DE LA INGENIERA GENTICA EN EL
MEDIO AMBIENTE
Microorganismos modificados genticamente estn siendo utilizados
para limpiar el medio ambiente de ciertos contaminantes , ya que
tienen la capacidad de transformarlos en sustancias no contaminantes
o de adsorberlos. Su accin se realiza de dos maneras
-Biorremediacin : bacterias transgnicas que degradan la materia
orgnica como los hidrocarburos con un gran rendimiento y en
diversas condiciones
-Bioadsorcin: Bacterias genticamente modificadas son capaces de
adsorber ciertos metales pesados que contaminan el suelo

8.-PROYECTO GENOMA HUMANO
El Proyecto Genoma Humano comenz en 1990 en los Estados
Unidos con un presupuesto de 375.000 millones de pesetas y un plazo
de 15 aos, con el objetivo de analizar molecularmente la herencia
gentica humana.
Se trata de realizar mapas de cada uno de los cromosomas humanos.
Implica dividir los cromosomas en pequeos fragmentos que puedan
ser caracterizados y posteriormente ordenados en el cromosoma.
Este proyecto supone la realizacin de dos tipos de mapas:
Mapas genticos: Estos mapas simplemente indican la
posicin relativa de los diferentes genes. Para esta
confeccin se estn estudiando la transmisin de
caracteres hereditarios, capaces de ser objetivados de una
generacin a otra en grandes familias.

En 1994 se termin el primer mapa gentico de todo el
genoma humano.

Mapas fsicos: De mayor resolucin, pues muestra la secuencia de
nucletidos en la molcula de ADN que constituye el cromosoma. Se
obtiene la secuencia de nucletidos de un gen. Se realiza
fundamentalmente mediante la electroforesis en geles de distintos
fragmentos de ADN y la ayuda de ordenadores.
El completar este mapa se ha conseguido cinco aos antes de lo que
se esperaba




CARACTERSTICAS PRINCIPALE DEL GENOMA HUMANO
-Slo 20000 a 25000 genes codifican protenas, mucho menos de lo
que se esperaba
-Los seres humanos son idnticos en un 99,9% y nos diferenciamos
en apenas unos tres millones de nucletidos
-La mayor parte de estas diferencias se encuentran localizadas en
los llamados polimorfismos de un nico nucletido que son
variaciones que afectan a un solo par de bases
. La mayor parte del genoma no es codificante y se le denomina
ADN basura que pareca que no tena ninguna funcin los
ltimos estudios los relaciona con funciones de regulacin de
la expresin de los genes
La genmica estudia ese genoma y sus objetivos principales son:
a) Identificar los genes codificadores de protenas
b) Estudiar las interacciones de los genes entre s