OBTENCIN Y ESTUDIO DE ASPECTOS BIOQUMICOS DE LAS ADSC

Francisco Zurita Daz

Sevilla 2012

TRABAJO FIN DE MSTER

NDICE

Introduccin.
Envejecimiento. Clulas Madre. ADSC.

Objetivos y Plan de Trabajo.

Resultados y Discusin.
Conclusiones.

ENVEJECIMIENTO BIOLGICO

Prdida progresiva de las f(x) ptimas de un organismo con el paso de los aos.
Consecuencia de factores intrnsecos y extrnsecos.

Causa Principal: ERO

Varias estrategias Terapias Celulares (CM)

Reparacin, Reemplazo y Regeneracin

Sustitucin, F. extracelulares, Movilizacin de las CM

CELULAS MADRE

2 Propiedades esenciales:

capacidad de auto-renovarse. potencialidad de dividirse en varios tipos celulares.

Tipos:

Totipotentes Cigoto. Pluripotentes ESC, iPSC. Multipotentes ASC.

CELULAS MADRE

Ventajas e Inconvenientes:
Ventajas Inconvenientes

ESC

Proliferacin Pluripotencialidad
Tumorognesis T. Autlogo No P. ticos T. Autlogo No P. ticos

Tumorognesis T. Alognico P. ticos

Multipotencialidad Proliferacin Tumorognesis

ASC

iPSC

ADSC

Tipo de MSC. Obtenidas a partir del Tej. Adiposo.

Fcil acceso Anestesia local Molestias para el paciente Abundancia No problemas ticos

Capacidad de diferenciacin hueso, cartlago, grasa, tendones,

m. esqueltico, tejido endotelial.

Ensayos clnicos E. de Crohn, E. Multiple, I. Miocardio

OBJETIVOS DEL TRABAJO

Optimizar la extraccin, cultivo y mantenimiento de MSC adultas de lipoaspirado humano Banco Celular. Estudio del cumplimiento de criterios del Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy. Puesta a punto un mtodo de obtencin de CM de tejido adiposo de rata. Elegir aquellas condiciones que menos afecte la viabilidad celular tras la descongelacin.

OBJETIVOS DEL TRABAJO

Como se afecta por HC la viabilidad, la citotoxicidad y la capacidad de diferenciacin de las CM de rata. Accin protectora de la melatonina frente al HC. Conocer si la vulnerabilidad de las CM humanas por parte del HC vara entre personas y depende de la edad. Desarrollar un mtodo para seguimiento de las CM in vivo. el marcaje y

PLAN DE TRABAJO

OBTENCIN, EXPANSIN, CRIOPRESERVACIN Y DESCONGELACIN.

DETERMINACIN DE LAS ADSC

Test de Adhesin Test de Multipotencialidad Test de fenotipado

ENSAYOS

Efecto de la criopreservacin sobre la viabilidad. Efecto sobre la citotoxicidad y viabilidad de ADSC tratadas con HC Efecto del HC y la melatonina sobre la capacidad de diferenciacin Efecto protector de melatonina Mecanismo de muerte celular tras el tratamiento con HC Efecto citotxico HC sobre CM de diferentes pacientes

MTODO PARA EL MARCAJE Y SEGUIMIENTO DE LAS CM IN VIVO

Transfeccion de ADSC de rata con lentivirus Seguimiento de las clulas trasplantadas por imgenes de bioluminiscencia ptica

OBTENCIN DE LAS ADSC

Obtencin de la Fraccin Vascular Estromal

Muestras acuosa

Lavado

Centrifugado

Eliminacin

fase

Filtrado (40 m) Colagenasa

Filtrado (100 m)

Obtencin de la SVF

Digestin con

Centrifugado

OBTENCIN DE LAS ADSC

Etiquetado y Separacin Magntica de las ADSC

Lisis de Eritrocitos

Marcaje con Ig

Criopreservacion

Incubacin

Cultivo

Separacin

DETERMINACIN DE LAS ADSC

Criterios para las MSC (Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society):

Adherentes al plstico.

Multipotentes, diferencindose, al menos, en osteoblastos, condroblastos y adipocitos.

Expresar los marcadores antignicos CD73, CD90 y CD105. Negativas para los marcadores c-kit, CD14, CD11b, CD34, CD45, CD19, CD79 y (HLA)-DR.

DETERMINACIN DE LAS ADSC

Test de Adhesin
ADSCh ADSCr

DETERMINACIN DE LAS ADSC

Test de multipotencialidad

Adipocitos

Fijacin Metanol Tincin Oil Red O Triglicridos y Lpidos Rojo

Osteoblastos

Fijacin Metanol Tincin BCIP/NBT S. de Fosfatasa Alcalina Azul Violeta

DETERMINACIN DE LAS ADSC

Test de multipotencialidad
ADSCh
Adipocitos Osteoblastos

ADSCr
Adipocitos

DETERMINACIN DE LAS ADSC

Test de fenotipado

Cocktail para fenotipado de MSC humanas: Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorforos:

Control isotpico humano: Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorforos:

DETERMINACIN DE LAS ADSC

Test de fenotipado en ADSCh

CD90-FITC

CD105-PE

CD14,
CD20,CD34 y CD45- PerCP

DETERMINACIN DE LAS ADSC

Test de fenotipado de ADSCr

CD90.1-FITC

ENSAYO DE CITOTOXICIDAD Y VIABILIDAD EN ADSCr

Mtodo Colorimtrico

Viabilidad

Dao DHG Formazan Abs490nm

Citotoxicidad Dao LDH Formazan Abs490nm

ENSAYO DE CITOTOXICIDAD Y VIABILIDAD EN ADSCr

Viabilidad

Citotoxicidad

ENSAYO DE CITOTOXICIDAD Y VIABILIDAD EN ADSCr

EFECTO DE LA CRIOPRESEVACION SOBRE LA VIABILIDAD DE ADSCr

Obtencin Almacenamiento Criopreservacin Uso

Criopreservacin
Medio+

10% SBF+1% Antibitico+ ? % DMSO

24

h a - 80 C N. Liquido

EFECTO DE LA CRIOPRESEVACION SOBRE LA VIABILIDAD DE ADSCr

1x106 clulas/ml
Muestra Concentracin total 0% de DMSO 5% de DMSO 10% de DMSO 20% de DMSO 40% de DMSO 0 cel/ml 7,9 x105 cel/ml 1,2 x106 cel/ml 1,0 x106 cel/ml 3,6 x105 cel/ml 0% 88% 92% 75% 32% Viabilidad

20 M de HC 3 h

EFECTO DEL HC Y LA MELATONINA SOBRE LA CAPACIDAD DE DIFERENCIACION DE LAS ADSCr

ADSC Tto. con HC durante 3h Diferenciacin Abs. xxxnm

EFECTO PROTECTOR DE LA MELATONINA SOBRE LA VIABILIDAD DE LAS ADSCr

30 M de HC 3h

EFECTO PROTECTOR DE LA MELATONINA SOBRE LA VIABILIDAD Y CITOTOXICIDAD DE LAS ADSCh

10 M de HC 3h Citotoxicidad

Viabilidad

MECANISMO DE MUERTE CELULAR DE LAS ADSCr

ADSCTto.10-80 M HC durante3 h. Determinar:
Clulas Viables Clulas Necrticas Clulas Apoptticas

Teir
anexina-V-FITC PI

MECANISMO DE MUERTE CELULAR DE LAS ADSCr

Teir
Anexina-V-FITC PS. Marcador de Apoptosis. PI ADN/ ARN. Marcador de Necrosis.

MECANISMO DE MUERTE CELULAR DE LAS ADSCr

Control
Estaurosporina

10M HC

20M HC

40M HC

EFECTO CITOTXICO DEL HC SOBRE LAS CM DE DIFERENTES PACIENTES

5-40 M HC 3 h

MARCAJE Y SEGUIMIENTO DE LAS CM IN VIVO

Transfeccin de ADSCr con lentivirus

MARCAJE Y SEGUIMIENTO DE LAS CM IN VIVO

Transfeccin de ADSCr con lentivirus

MARCAJE Y SEGUIMIENTO DE LAS CM IN VIVO

Seguimiento de las CM trasplantadas por imgenes de bioluminiscencia ptica

Da

tras

el

Zona

Bioluminiscencia (p/s/cm2/sr)

trasplante DIA 1 MANO CABEZA DIA 4 MANO CABEZA DIA 8 MANO CABEZA

2.045 x 10 2.327 x 10 7.546 x 10 9.111 x 10 3.165 x 10 1.1821 x 10

08

05

06

04

06

05

CONCLUSIONES

Las ADSC obtenidos cumplen los requisitos como MSC. 10 % DMSO ptima para la congelacin. El HC afecta la viabilidad, la citotoxicidad y la diferenciacin de las ADSC, ejerciendo la melatonina un papel protector. Las ADSC de pacientes de ms edad parecen ser ms sensibles al HC.

Sistema de anlisis de imagen in vivo, pudimos observar que las clulas transfectadas con el gen de la luciferasa y trasplantadas en animales fueron visibles en la zona de inyeccin, dando seal, al menos, hasta el octavo da.

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OBTENCIN Y ESTUDIO DE ASPECTOS BQ DE LAS ADSC

MUCHAS

GRACIAS