LISTERIA monocytogenes

Anlisis Microbiolgico Tecnlogo Qumico

Ana Loinaz Joseline Dos Santos Vanesa Pinto Florencia Quintana

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Clasificacin cientfica :
DOMINIO: Bacteria FILO: Firmicutes CLASE: Bacilli ORDEN: Bacillales FAMILIA: Listeriaceae GNERO: Listeria ESPECIE: L. monocytogenes NOMBRE BINOMIAL: Listeria monocytogenes
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Qu es la Listeria Monocytogenes?:
Bacteria que puede generar una enfermedad transmitida por alimentos (ETA) llamada Listeriosis. Dicha bacteria se encuentra en el suelo, el agua y en algunos animales, entre los que se encuentran las aves de corral y el ganado. Puede estar presente en una gran variedad de alimentos, incluyendo especialmente leche cruda, alimentos elaborados con ella y carnes procesadas. Puede subsistir en plantas de procesamiento de alimentos y contaminar los que all se producen. La contaminacin puede ocurrir en el proceso de elaboracin, empaque o en el almacenamiento de los alimentos. Los alimentos contaminados no cambian ni de sabor ni de olor. La Listeria se diferencia de muchos otros grmenes por poder reproducirse incluso a las fras temperaturas del refrigerador. Mediante la coccin o la pasteurizacin se elimina a la bacteria. Page 3

Caractersticas:
Es uno de los patgenos causante de infecciones alimentarias ms virulentos, con una tasa de mortalidad entre un 20 a 30%, ms alta que casi todas las restantes toxicoinfecciones alimentarias. Bacteria intracelular facultativa causante de la LISTERIOSIS. Es una bacilo Gram positivo. No esporulador. Anaerobio facultativo. Es capaz de crecer en un amplio rango de temperaturas (1C a 45C) y una elevada concentracin de sal. Es catalasa positivo y no presenta cpsula ni espora. Tiene flagelos pertricos, gracias a los cuales presenta movilidad a 30C o menos, pero es inmvil a 37C, temperatura a la cual sus flagelos se inactivan. Page 4

Factores que afectan el crecimiento:

Mnima Temperatura C pH Actividad del agua -0.4 4.39 0.92 ptima 37 7.0 -----Mxima 45 9.0 ------

Resiste bien la congelacin. Sensible a la mayora de los desinfectantes. Sensible a tratamiento trmicos y radiaciones. Crecimiento poco afectado por la atmsfera gaseosa. Page 5

Patogenia:
Listeria monocytogenes es una patgeno facultativo intracelular que puede crecer en los macrfagos, las clulas epiteliales y los fibroblastos en cultivo. Tras la ingesta de alimentos contaminados, L. monocytogenes puede sobrevivir a la exposicin a enzimas proteolticas, cido gstrico y sales biliares. Las bacterias pueden internalizarse en las clulas gracias a la interaccin de las protenas de superficie bacteriana (internalinas) con los receptores para glucoprotenas de la superficie de la clula husped. El microorganismo, gracias a dos enzimas diferentes de fosfolipasa C y a la toxina bacteriana listeriolicina O, se libera del fagolisosoma del husped y experimenta una rpida divisin en el citosol de sta clula antes de ser encapsulado por medio de filamentos cortos de actina. Estos filamentos se reorganizan en una larga cola que se extiende desde un solo extremo de la bacteria. Mediante los movimientos de la cola el microorganismo migra por el citoplasma hacia la membrana de la clula husped. En la periferia se forman protrusiones (filpodos) que pueden penetrar en las clulas adyacentes y que permiten el ingreso de la bacteria.

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Listeriosis:
La listeriosis es una infeccin debida a la bacteria Listeria monocytogenes. Una zoonosis poco frecuente en humanos, pero extremadamente grave. Tiene poca morbilidad, pero muy alta mortalidad, el 30%, que en caso de grupos sensibles se eleva an ms, hasta un 70%. La contaminacin tiene lugar generalmente durante el consumo de alimentos que contienen la bacteria responsable de la enfermedad. Son alimentos poco tratados, con mucha vida til en refrigeracin y sin necesidad de aplicarles ningn tratamiento (Abrir y listo). Entre estos alimentos estn la leche cruda, queso elaborado con esta leche, carne cruda o mal cocinada, verduras crudas, embutidos, pats, quesos frescos o poco curados (camembert, brie, etc.). La mujer puede transmitir el bacilo al feto durante el embarazo (por medio de la placenta) o en el momento del parto. Page 7

Sntomas Listeriosis:
Los sntomas suelen comenzar entre 3 y 70 das despus de la exposicin a la bacteria y normalmente incluyen: Fiebre persistente Dolores musculares Diarrea Nuseas (a veces) Vmitos (a veces) En caso que la infeccin se disemine al sistema nervioso los sntomas tambin podran incluir: Dolor de cabeza Convulsiones Vrtigo El tiempo que dura la enfermedad puede variar dependiendo de la severidad de la misma.
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Sntomas Listeriosis:

La susceptibilidad es mayor en nios, ancianos, embarazadas e inmunodeprimidos. Los sntomas son una primera forma intestinal asintomtica parecida a la gripe y despus: Embarazadas: aborto, incluso a trmino o nacimiento de nios con septicemia. Nios y ancianos: grave tendencia a la septicemia, meningitis, endocarditis, neumona y muerte en el 40% de los casos. Adultos sanos: meningitis, meningoencefalitis, trastornos respiratorios, mortalidad del 30%.

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Contaminacin:
Tiene lugar generalmente durante el consumo de alimentos que contienen la bacteria de la enfermedad. Entre estos alimentos estn: Quesos blandos de estilo mexicano como por ejemplo: queso blanco, queso fresco, queso de hoja, queso de crema y asadero. Quesos tipo feta: Brie, Camembert, queso azul y Roquefort. Alimentos preparados: salchichas, embutidos, fiambres y otras comidas preparadas. Coma estos alimentos slo si se recalientan hasta que desprenden vapor. Hasta las carnes curadas como el salame deben calentarse. Carnes, pescados y mariscos: cocine estos alimentos completamente. No coma carnes, pescados y mariscos a medio cocer. Restos de comida: es importante recalentarlos hasta que desprendan vapor. Frutas y verduras: la listeria puede crecer en algunas frutas y verduras. No compre meln en rodajas. Lave todas las frutas y verduras con agua. Frote las frutas y verduras duras, como pepinos y melones con cepillo limpio.

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Tratamiento:
La listeriosis se trata con la asociacin de dos antibiticos durante un perodo de 3 semanas, aunque hay que tener en cuenta el alto ndice de mortalidad. Actualmente se considera que las mejores opciones son la penicilina o la ampicilina, solas o asociadas a gentamicina. En el manejo de estas infecciones son de gran importancia el empleo de dosis altas y la duracin adecuada del tratamiento, que deben individualizarse. En las enfermedades graves como la cerebritis o la granulomatosis infantisotica, el inicio precoz del tratamiento es fundamental para el control de la infeccin. La combinacin de trimetoprim y sulfametoxazol se ha utilizado con xito en pacientes alrgicos a penicilinas, considerndose en la actualidad la terapia alternativa en esta circunstancia.
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Prevencin:
Evitar contraer la infeccin durante el embarazo. No consumir las verduras crudas o poco cocidas. Preferir los embutidos envasados a los que venden cortados al momento. Volver a cocer los alimentos conservados en el refrigerador. Hervir la leche cruda a pasteurizada antes de consumirla y no fiarse de los productos artesanales. Por otro lado, es aconsejable lavarse las manos despus de haber manipulado los alimentos crudos, limpiar y desinfectar regularmente el refrigerador.

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Bsqueda de Listeria Monocytogenes:

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Composicin caldo fraser g/L:

Polipeptona.10 Extracto de levadura..5 Extracto de carne.5 Cloruro sdico20 Fosfato disdico anhidro..9,6 Fosfato monopotsico1,35 Esculina.1 Cloruro de litio3 El caldo fraser de media concentracin es utilizado para el crecimiento selectivo de Listeria monocytogenes en alimentos. Principios en los que se basa: Listeria monocytogenes hidroliza la esculina del medio en medio en glucosa y esculetina, que forma un complejo de color negro con los iones frricos provenientes del citrato frrico. La elevada concentracin de cloruro sdico del medio incrementa su selectividad, mientras que el cloruro de litio inhibe el crecimiento de la mayora de los cocos entricos que tambin pueden hidrolizar esculina.

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Composicin de AGAR OXFORD en g/L:

Bacto Columbia Blood Agar Base39,0 Esculina....1,0 Citrato frrico amoniacal..0,5 Cloruro de litio..15,0 Agar bacteriolgico..2,0 pH a 25C 7,2 0,2 Medio de cultivo selectivo utilizado para Listeria monocytogenes. Principios en los que se basa: El agar sangre le aporta nutrientes y cofactores para el crecimiento. La selectividad del medio est dada por el cloruro de litio. La diferenciacin en medio OXFORD se da por la hidrlisis de la esculina. El producto de la hidrlisis (esculetina) reacciona con iones frricos hasta producir complejo de marrn a negro. Page 15

En AGAR OXFORD se obtienen colonias pequeas de color grisceo rodeadas de un halo negro.

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Composicin de AGAR PALCAM en g/L:

Bacto Columbia Blood Agar Base39,0 Glucosa..0,5 Esculina..1,0 Citrato frrico amoniacal..0,5 Cloruro de litio..15,0 Manitol..10,0 Rojo fenol.........0,08 Clorhidrato de acriflavina..0,005 Sulfato de polimixina B.0,01 Ceftazidima0,008 Bacto agar....2,0 pH a 25C 7,2 0,2 Medio de cultivo selectivo utilizado para Listeria monocytogenes. Principios en los que se basa: El agar sangre le aporta nutrientes y cofactores para el crecimiento. La selectividad del medio est dada por: cloruro de litio, sulfato de polimixina B, clorhidrato de acriflavina y ceftazidima. La diferenciacin en medio PALCAM se da por la hidrlisis de la esculina y la fermentacin del manitol. El producto de la hidrlisis (esculetina) reacciona con iones frricos hasta producir complejo de marrn a negro. El manitol y el rojo fenol sirven para diferenciar las cepas fermentadoras del manitol de las especies de Listeria. La Page fermentacin del manitol hace que el rojo fenol se vuelva amarillo.

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En AGAR PALCAM se obtienen colonias color verde con reflejos grisceos eventualmente con centro negro y rodeadas de un halo negro.

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CONFIRMACIN DE LISTERIA SP.:

A partir de cada placa incubada, tomar 5 colonias presuntivas de Listeria sp. (si una placa tiene menos de 5 colonias, retenerlas todas). Aislar en TSYEA (agar triptona soya extracto de levadura). Incubar a 37C 1C durante 18hs24hs (o hasta desarrollo satisfactorio). En medio TSYEA las colonias son convexas, incoloras, translcidas y con bordes regulares.
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Prueba de la catalasa: Realizar la prueba en una colonia aislada en TSYEA. Coloracin de Gram: Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeos y finos bacilos Gram (+). Examen de movilidad: Sembrar por picadura una colonia en AM (agar movilidad). Incubar a 25C 1C durante 48hs (si es necesario dejar 3 das ms). Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son mviles y dan una cultivo tpico en forma de sombrilla.

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Prueba de movilidad:
Sirve para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos (existen algunas formas de cocos mviles) El medio agar movilidad permite la realizacin de esta prueba por ser semislido ya que presenta solamente 3,5 g/L de agar. En estas condiciones, las bacterias mviles producirn un enturbiamiento homogneo del medio debido a la distribucin aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmviles permanecern en la misma lnea de la picadura en que se sembraron.
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CONFIRMACIN DE LISTERIA MONOCYTOGENES:

Investigacin de la hemlisis: Sembrar por picadura en AS (agar sangre) una colonia aislada en TSYEA. Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (Listeria innocua). Incubar 37C 1C durante 24hs 2hs. Examinar con luz blanca. Listeria monocytogenes presenta una estrecha zona clara y ligera -hemlisis. Utilizacin de glcidos: Sembrar en xilosa y ramnosa una colonia aislada en TSYEA. Incubar a 37C 1C durante 5 das. Si la reaccin es positiva si aparece una coloracin amarilla. Test CAMP: Sembrar en paralelo en AS las cepas Rhodococcus equi y de Staphylococcus aureus. Sembrar en perpendicular las cepas problemas, junto con dos cepas control (Listeria monocytogenes y Listeria innocua). La reaccin es positiva si hay una aumento de la zona de -hemlisis en la interseccin de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.

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Hemlisis:
Esta prueba nos permite determinar la capacidad que poseen ciertas bacterias de producir enzimas extracelulares, capaces de actuar sobre los glbulos rojos, produciendo de sta manera la lisis. La produccin de stas enzimas dependen de muchos factores ambientales como pH o atmsfera de incubacin. Las reacciones hemolticas se clasifican generalmente como ALFA, BETA o GAMMA de acuerdo al tipo de lisis que se da.
Hemlisis alfa: se refiere a una lisis parcial de eritrocitos que produce una coloracin verdegrisceo que se observa alrededor de las colonias. Hemlisis beta: produccin de zona coloreada de amarillo ms o menos claro (Listeria monocytogenes). Hemlisis gamma: se refiere a la ausencia de hemlisis.

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Identificacin de gnero:
La observacin en la tincin de Gram da una colonia de bacilos gram-positivos. Son catalasa positivos. Producen cido de la D-glucosa. Hidrolizan la esculina. Son mviles. Capacidad de producir hemlisis. Dan resultados positivos a las pruebas bioqumicas: VogesProskauer y Rojo Metilo.

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Interpretacin:
Todas las listerias sp. se presentan como pequeos bacilos Gram (+), mviles, catalasa (+). Listeria monocytogenes se diferencia de las dems especies por las siguientes caractersticas:
Produccin cido
ESPECIE L. monocytogenes L. innocua L. ivanovii L.seeligeri L. welshimeri L. grayi HEMLISIS + + (+) Ramnosa + V V Xilosa + + + -

CAMP (test)
S. aureus + (+) R. equi + -

Siendo: *V: reaccin viable *(+): reaccin dbil *+: reaccin positiva en ms de 90% * -: ausencia de reaccin

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