UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA Docente: Martha A Mora Garca. Esp. Bacteriologa lll Manejo de muestras biolgicas.

CLASIFICACION TAXONOMICA
Dominio: Filo: Orden: Suborden: Familia: Gnero:

Bacteria Actinobacteria Actinomycetales Corynebacterineae Mycobacteriaceae Mycobacterium.

Caractersticas Generales
Aerobias estrictas (excepto en estado latente)
No mviles Pared celular rica en lpidos

M. tuberculosis su nico hospedero es el humano

Tiempo de replicacin muy lento, 15-20 horas Clasificacin:
Complejo Tuberculoso: Niacina y nitritos positivos,

catalasa a 68C negativa

CARACTERISTICAS

PARED CELULAR
PECTIDOGLICANO POLIMEROS DE ARABINOSA Y GALACTOSA.

ACIDOS MICOLICOS
LIPIDOS SUPERFICIALES: Cord factor

Micosidos Sulfolipidos.

PARED CELULAR MICOBACTERIAS

Pared celular micobacterial: 1-lpidos externos, 2-cido miclico, 3-polisacridos (arabinogalactano), 4-peptidoglicano, 5-membrana plasmtica, 6-lipoarabinomanano (LAM), 7-fosfatidilinositol manosido, 8-pared celular.

CARACTERISTICAS GENERALES
BACILOS ACIDO ALCOHOL RESISTENTE UTILIZAN AMONIACO COMO FUENTE DE NITROGENO PARA SU CRECIMIENTO

LA MAYORIA SON DE CRECIMIENTO LENTO

AEROBIAS Y NO MOVILES

GLICEROL COMO FUENTE DE CARBONO EN PRESENCIA DE SALES MINERALES

POSEEN PARED CELULAR

NO TIENEN: ENDOSPORA,CAPSULA

GENEROS
COMPLEJOS

TUBERCULOSIS
M. tuberculosis M. bovis M. africanum

COMPLEJO LEPRA
M. Leprae M. Lepraeemurium

MICOBACTERIAS ATIPICAS
M. kansassi-intermedium-marinum Scrofulaceum-xenopi-avium-Intracelular Fortuitum y chelonei-gordonae-szulgai

Epidemiologa

El mtodo ms efectivo de control de la TB es la bsqueda activa de casos bacilferos y su tratamiento, ya que desde el punto de vista epidemiolgico la infectividad del paciente disminuye en forma importante a las pocas semanas de iniciado un buen tratamiento, y por el contrario un paciente bacilfero infecta de 10 a 15

personas por ao.

ANTIGENICIDAD
LIPIDOS PROTEINAS MICOBACTINAS EXOQUELINAS

Cord factor Tuberculina

CORD FACTOR

SULFOLIPIDOS

MICOBACTINAS Y EXOQUELINAS

Permite el entrelazado de los bacilos, favoreciendo la formacin de "verdaderas cuerdas" que los hacen difciles de atacar..

Sustancias que recuperan Aumenta toxicidad del el hierro a partir de la cord factor e inhibiendo la transferrina permitiendo DETERMINANATES DE PATOGENICIDAD as el crecimiento del funcin lisosomabacilo tuberculoso fagosoma virulento

Determinantes de patogenicidad
Factor cordn: Adoptan la forma serpenteante constituido por bacilos que se disponen de manera paralela y compacta, el desarrollo en cordones puede correlacionarse con la presencia del glucolipido trehalosa 6,6 dimicolato.
Sulfatados: Son glicolpidos localizados de forma perifrica responsables de la reactividad al rojo neutro, aunque los sulfatados no son txicos pero cuando se administran de forma simultanea con el factor cordn potencia de manera sinrgica la toxicidad de este. Intracelularidad: promover su propia supervivencia dentro del husped actuando desde el interior de los fagosomas para

prevenir la formacin de los fago lisosomas con lo que evita su exposicin a enzimas hidrolticas ( lizosomicas).

MYCOBACTERIUM - TUBERCULOSO
CUADRO CLINICO
Se establece en tres fases: INFLAMACION FORMACION DEL TUBERCULO CACEIFICACION

CUADRO CLINICO

ESTADIOS

PRIMO-INFECCION

REINFECCION

Ciclo de vida

Patognesis
Durante la fase de invasin tisular, el transporte de microorganismos

por el macrfago a travs de la pared alveolar, permite el acceso del bacilo a la sangre a travs de la va linftica.

Este perodo de micobacteremia le proporciona al microorganismo el

acceso y posibilidad de permanecer en el sistema mononuclear fagoctico y sitios que le proveen un medio ambiente favorable (alta presin de oxigeno) , como es el rea apical de los pulmones y sitios con alto flujo sanguneo como nodos linfticos, riones, epfisis de huesos largos, cuerpos vertebrales y reas menngeas. extrapulmonar y a la forma pulmonar apical de ms frecuente presentacin.

La reactivacin tarda de estos focos da origen a la tuberculosis

Patognesis
Las vas de entrada del bacilo tuberculoso al organismo son

la inhalacin, ingestin e inoculacin directa. La ms importante es la inhalacin de partculas infectantes expulsadas por medio de la tos de un paciente bacilfero. Partculas mayores de 10 m son filtradas en la nariz y menores de 5 m evitan las barreras mecnicas y pueden penetrar y depositarse en la superficie respiratoria.
La respuesta inmune celular efectiva, cura la lesin

primaria espontneamente con calcificacin del foco parenquimatoso (Foco de Gohn y ndulos hiliares) constituyendo el complejo de Ranke.

Patognesis
Los linfocitos T, sensibilizados con antgenos del M. tuberculosis

determinan la aparicin del fenmeno de hipersensibilidad retardada medida a travs de la prueba de tuberculina. hipersensibilidad retardada, son capaces de producir linfoquinas que activan la capacidad microbicida del macrfago y junto con el linfocito organizan el granuloma, el cual sirve para detener la infeccin, reducir el crecimiento del bacilo y restringir la movilidad de los macrfagos infectados, evitando la diseminacin de la infeccin. por VIH,hay falta de formacin de granuloma y no se restringe la movilizacin del macrfago infectado, resultando en la tuberculosis miliar o de diseminacin hematgena.

Los linfocitos (especficamente CD4) de individuos con fuerte

En individuos con inmunodeficiencia como la producida por infeccin

Manifestaciones clnicas.

Debilidad Malestar general Perdida de peso Perdida del apetito Fiebre de predominio visceral Sudoracin nocturna El compromiso particular pulmonar caractersticamente se asocia a tos hemoptoica (tos con expectoracin y presencia de sangre) Dolor Torxico

Formas Clnicas
La entrada del bacilo al organismo produce la PRIMO-

INFECCION TUBERCULOSA, con lesiones generalmente limitadas, pero con persistencia de bacilos en forma latente, sin multiplicacin, pero que se expresan en una prueba de tuberculina positiva en pacientes asintomticos. vida, o sufrir reactivacin posterior cuando el estado inmune del husped lo permita.

Estas lesiones pueden permanecer inactivas el resto de la

La mayor parte de los casos de ENFERMEDAD

TUBERCULOSA son producidos por la reactivacin endgena y menos frecuentemente por nueva infeccin o infeccin exgena, la cual puede ser reconocida por la caracterizacin del genotipo del M.tuberculosis.

Presentaciones clnicas
Tuberculosis pulmonar.
Tuberculosis menngea. Tuberculosis extra pulmonar.

Tuberculosis milliar.
Tuberculosis linftica. Tuberculosis genitourinaria.

Tuberculosis gastrointestinal.

Formas Clnicas
L a forma pulmonar es a mas frecuente, pero el compromiso extrapulmonar

es la mas frecuente en pacientes con algn factor de inmunosupresin.

Las manifestaciones clnicas de la tuberculosis pueden ser:

Sistmicas relacionadas con la infeccin por s misma (fiebre, malestar

general, prdida de peso, diaforesis nocturna, anorexia, adinamia, anemia, leucocitosis o leucopenia.

Locales determinadas por el rgano o sistema comprometido.

Metablicas como hiponatremia por secrecin inapropiada de hormona

antidiurtica y anormalidades neurosicolgicas como depresin.

Patognesis en Tuberculosis
10% de personas que se infectan con Tb y tienen un sistema inmune normal desarrollarn Tb en algn momento de su vida
Pacientes con HIV tienen el mayor riesgo de desarrollar Tb, 7-10% cada ao Otras patologas tambin incrementan el riesgo para que la infeccin progrese a enfermedad.

El Panorama Actual de la Tuberculosis en el Mundo

Un tercio de la poblacin mundial est infectado con

el bacilo M. tuberculosis.
7.5 millones de casos nuevos por ao Se presentan 2,8 millones de muertes por ao

Problema Actual
Aumento en el nmero de casos Fallas en los programas de salud pblica que manejan la

vigilancia de casos y controles

La no supervisin del tratamiento (TAS-DOTS)

Retardo en el diagnstico tanto clnico como

microbiolgico

Aumento de la resistencia a medicamentos tradicionales Disminucin de las posibilidades teraputicas

MDR - XDR
MDR: aislamiento resistente al menos a isoniazida y

rifampicina

XDR: aislamiento MDR con resistencia a la quinolona (

ofloxacina, ciprofloxacina) y algunos de los inyectables: kanamicina, amikacn o capreomicina

Plan Nacional de Salud pblica Colombia 2007-2010

Estrategias para disminuir los riesgos para las enfermedades transmisibles y las zoonosis:

Implementar el Plan Estratgico Colombia Libre de TB 2006-2015

Metas Mundiales y Adoptadas en los Niveles Nacionales

2005: Diagnosticar al 70% de los casos TBP Bk+ Curar al 85% de los casos TBP Bk+ 2015 (objetivos de desarrollo del milenio) Disminuir de forma significativa la prevalencia y mortalidad 2050 Eliminar la TB como un problema de salud pblica (<1 caso por 1 milln de habitantes)

Desafos del Control de TB

Pobreza Desnutricin Poblaciones vulnerables

Indgenas Desplazados Poblacin carcelaria y penitenciaria

Coinfeccin TB/VIH MDR- XDR TB Reformas del sector salud

Niveles de Laboratorio
Nivel I:
Recoge muestras y realiza baciloscopia y remite muestras a nivel

superior.

Nivel II:
Realiza baciloscopia Cultivos en medios a base de huevo Identifica M. tuberculosis Pruebas de sensibilidad a primera lnea

Nivel III:
Mismos procesos del nivel II mas:
Mtodos de cultivo diferentes a a LJ O OK Identificacin de MNT Sensibilidad a medicamentos de primera y segunda lnea

DIAGNOSTICO

PRUEBA DE TUBERCULINA

RADIOGRAFIA DE TORAX

MICROBIOLOGIA Baciloscopia Cultivo Tcnicas moleculares

Elementos en el Diagnstico de Tuberculosis

SINTOMTICOS RESPIRATORIOS

Historia Clinica Examen fisico tuberculina Estudios radiolgicos

Baciloscopia: Examen directo con coloracin para

bacilos cido alcohol resistentes

Cultivo

Proceso de la Muestra en el Laboratorio

Pulmonares Descontaminacin: NaOH 4% Mucoltico: Nacetyl cistena Estriles siembra directa
MGIT LJ

+
AR
Centrifugacin 4C

Sedimento Inocular Incubacin

CD
MGIT

Identificacin Fenotpica-Genotpica

Proceso de las muestras

Pulmonares Decontaminacin

AR
MGIT LJ

Muestra

Centrifugacin
Incubacin 36C

Extra-pulmonares Incubacin
KY
CD
MGIT

AR

Identificacin

Adenosin Deaminasa (ADA) Citoquinas

Enzima producida por linfocitos Evaluada extensamente en tuberculosis pleural, peritoneal,

meningitis
Citoquinas: Interferon y TNF Mtodos rpidos, simples, no invasivos Poca precisin si se utilizan como nica prueba

PRUEBA DE TUBERCULINA
INYECCCION INTRADERMICA: SU POSITIVIDAD INDICA: Seguridad de proteccin Vacunacin previa Riesgo de desarrollar enfermedad por reactivacin INDURACION MAYOR DE 10 mm de dimetro, con sintomatologa Enfermedad actual.

DIAGNOSTICO

Tiempo de Lectura 72 horas

POSITIVA +10 mm DUDOSO 5-9 mm

MUESTRAS PARA INVESTIGAR Mycobacterium

ESPUTO
LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO ORINA BIOPSIAS MUESTRAS DE PIEL ASPIRADOS BROCOALVEOLARES OTROS LIDQUIDOS ORGANICOS PIEL

MEDIOS DE CULTIVO INVESTIGACION DE MICOBATERIAS

LOWENSTEIN JENSEN OGAWA KUDOH

STONENENBRING
MIDDLEBROOK AGAR y CALDOS 7H9 -7H10 Y 7H11.

Factor Cordn M.tuberculosis

Factor Cordn M.tuberculosis Agar CD

Colonia MTB en LJ

Colonia MTB en LJ

Reduccin de Nitratos + + +

Niacina

Pirazinamidasa Cat 68C

Pruebas bioqumicas

Mtodos para Deteccin Rpida de M. tuberculosis a partir de la Muestra

Amplificacin de cidos

nuclecos

Sistemas capaces de detectar

pequeas cantidades de materia gentico (secuencias de DNA

PCR (IS6110) Secuenciacin (gen 16S rRNA) Sondas. Genes de resistencia (rpoB, Kat G)

Roche: Amplicor Mycobacterium tuberculosis test The Gen-Probe Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD) The BD ProbeTec (multiplex strand displacement system) INNO-LIPA PCR casera Otros genes de resistencia: MBP64, rpob,
hsp65

PCR sensibilidad en muestras Bk +: 90100% y en muestras Bk-: 6070%

TRATAMIENTO
FARMACOS
ISONIAZIDA RIMFAMPICINA PIRAZINAMIDA ESTREPTOMICINA ETHAMBUTOL

Pruebas de Sensibilidad
Mtodo de las proporciones
Directa Indirecta

MGIT 960 Bactec 460* Alamar Azul Nitrato Reductasa Dx Molecular Genes de resitencia:
Rpob: Rifampicina KG: Isoniazida

Mtodo Proporciones directas M. tuberculosis, INH (R), RIF (R), 8 Das

ACD ACD+INH

ACD+PNB ACD+RIF

Proporciones Indirecto

Micobacterifagos
Micobacterifagos (D29) s una

metodologa rpida que puede ser aplicada directamente a la muestra, no requiere de infraestructura especial y su costo es bajo. Adems ha sido aplicado con xito en la deteccin de resistencia, especialmente la resistencia a rifampicina

Nuevas Pruebas para el Diagnstico de Tuberculosis Activa

Las limitaciones de la microscopa y el lento crecimiento en los medios tradicionales para hacer diagnstico de infeccin por M. tuberculosis, ha hecho que todas las herramientas nuevas estn enfocadas en buscar un a metodologa ideal:
La prueba ideal sera aquella que permitiera una identificacin temprana del bacilo y el diagnstico

rpido de su sensibilidad especialmente la identificacin de los aislamientos MDR

PRESENCIA DE BAAR Y PMN

Mtodos para Aislamiento de Micobacterias

Coloracin para BAAR: Auramina Rodamina (AR) Kinyoun Cultivo: Lowenstein-Jensen (LJ) Middlebrook 7H11 (capa delgada: CD) Sistema MGIT: Positivos: Subcultivos a CD Coloracin para BAAR

32C - 37C

MICOBACTERIAS ATIPICAS
MYCOBACTERIAS ATIPICAS

CARACTERISTICAs
MORFOLOGIA COLONIAS PRODUCCION DE PIGMENTO VELOCIDAD DE CRECIMIENTO

CUADRO CLINICO
INFECCION PULMONAR ADENITIS CERVICALES INFECCIONES EN PIEL INFECCIONES TEJIDOS BLANDOS

DIAGNOSTICO
CLINICO RADIOLOGICO MICROBIOLOGICO MOLECULAR

PARAMETROS PARA CLASIFICACION

1. MORFOLOGIA DE COLONIAS 2. PRODUCCION PIGMENTO FOTO Y ESCOTO 3. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO

Grupos Establecidos
GRUPO I GRUPO II GRUPO III GRUPO IV

Fotocromogenas Escotocromogenas No fotocromogenas Crecedores rapidos Crecedores lentos.

Clasificacin de Micobacterias segn el riesgo de infeccin en humanos*

Grupo Riesgo I
M. gordonae M. tokaiense M. flavescens M. smegmatis M. gastri, M. terrae M. mucogenicum M. chitae M. parafortuitum M. hassiacum M. triplex M. phlei M. hiberniae M. triviale M. obuense M. hodleri M. vaccae. M. confluentis. M. nonchromogenicum, M. porcinum ,M. cookii M. Interjectum M. branderi M. gilvum M. aurum M. madagascariense M. sphagni M. Moriokaense M. neoaurum . M.gadium
M. celatum ,M. chelonae ,M. fortuitum ,M. avium, M. abscessus , M. xenopi, M. malmoense, M. intracellulare, M. haemophilum, M. kansasii M. paratuberculosis, M. genavense M. marinum, M. ulcerans, M. peregrinum, M. scrofulaceum, M. szulgai

Grupo Riesgo II

Grupo Riesgo III

M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M leprae

*Practical handbook for the phenotypic and genotypic identification of mycobacteria

Toma de Muestra
Muestras recomendadas: Biopsias

En tubo tapa rosca y estril (seco)

Material obtenido por puncin Tubo tapa rosca y estril

Muestras No recomendadas Aplicadores de algodn

Recomendaciones
Confirmar diagnstico de infeccin por MNT siempre con cultivos, con la identificacin de la especie Correlacionar los resultados del laboratorio con otros hallazgos (epidemiologa, clnica, histopatologa) Realizar pruebas de sensibilidad Terapia con antibiticos especfica + drenaje y/o reseccin

Clasificacin
Fenotpica:
Tiempo de crecimiento Caractersticas morfolgicas

Produccin de pigmento Morfologa de colonia

Reacciones bioqumicas HPLC (perfil de cidos miclicos)

Genotpica:
Deteccin de regiones altamente conservadas dentro del genoma Deleciones, inserciones que son especie especficas

Clasificacin por secuenciacin del gen 16S rRNA PCR del gen hsp 65 con Enzimas de restriccin (PRA)

Lesiones

Toma de Muestras

Microcolonias NT

M.fortuitum

M.chelonae

M.avium M.tuberculosis

M.tuberculosis

Microcolonias

Identificacin Fenotpica

Cromatografa Lquida de Alta Presin HPLC

HPLC analiza la

composicin de los cidos miclicos de la pared de la micobacteria, cada especie tiene un perfil especfico de cidos miclicos. Es un mtodo con alta sensibilidad y especificidad. Su limitacin los altos costos del equipo y personal altamente especializado.

Identificacin inicial
Tiempo de crecimiento

>7 das: LENTO < 7 das: RPIDO

No cromgeno: No produce pigmento

Fotocromgeno: Produce pigmento en presencia de luz

Escotocromgeno: Produce pigmento en luz y oscuridad

Identificacin Fenotpica
Arylsulfatasa Positiva R. Nitratos Positivos NaCl Positivo Manitol Positivo M. peregrinum negativo M. fortutitum Negativo M. chelonae Cto. 32C Negativos Positivo M. smegmatis Negativa Cto. 45C Negativo M. chitae

Positivo

Crecedores Rpidos-No pigmentados

M. abscessus

Identificacin Fenotpica
Nitratr Reduction

Positive

Negative

Grow NaCl

Urease

Positive

Positive

M. flavescens*

M. scrofulaceum

Negative

Negative

M. szulgai

M. gordonae

Grow 45C positive

M. xenopi

Crecedor Lento - Escotocromgeno

Identificacin Fenotpica
Nitrate Reduction

Positive

Negative

Tellurite R

Urease

Positive

Negative

Positive

Negative

M. Szulgai*

M. kansasii

Tween H

M. asiaticum

Positive

Negative

M. marinum

M. simiae

Crecedor Lento - Fotocromgeno

Identificacin Fenotpica

Cultivos Rpidos en Medio Lquido

Estos sistemas miden cambios en la presin de gases como la

produccin de dioxido de carbono, el consumo de oxigeno. Hacen un monitoreo continuo del cultivo Multiples estudios han mostrado las ventajas de estos sistemas en el aumento en el porcentaje de recuperacin La disminucin en el tiempo de crecimiento Disminucin de el % de contaminacin.

Septi-Chek MGIT 960 (Tubo Indicador de Crecimiento de Micobacterias) MGIT manual Bactec 460 * BACTEC 9000MB. MB/BacT

Mtodos para Realizar Diagnstico de Infeccin por Micobacterias

Coloracin para BAAR: (Se:45-70%)

ZN Kinyoun

Auramina-Rodamina
Medios a base de huevo (LJ- OK) Medios con frmula definida:

Cultivos:

(Middlebrook: 7H9-7H10-7H11-7H12*)

Sistemas automatizados

Bactec 460*- MGIT (Becton Dikison)

Hemocultivos

HPLC Sondas PCR

Moleculares

GRACIAS POR SU ATENCION.