EDUAR DAVID CARABALLO

Microscopa De Fluorescencia

Microscopa de Fluorescencia

Fluorescencia: propiedad que poseen determinadas sustancias ( fluorescentes )de emitir, bajo la accin de radiaciones de onda corta, otras radiaciones de longitud de onda ms larga. Espectro Electromagntico
Rayos Gamma Ultravioleta RayosX Visible Infrarrojo Microondas

Longitud de onda

0.1

180

340

750

400 . 103

Microscopio de fluorescencia
La fluorescencia es un fenmeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir George Stokes en el ao 1852, para luego ser explicada fsicamente en el ao 1935 por Alexander Jablonski (107). Es la propiedad que tienen ciertos elementos qumicos denominados fluorforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiacin intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromtica azul) y luego emiten otra luz de una mayor longitud de onda (de un determinado color, verde, rojo, amarillo) (fig. 6-21). Es un fenmeno de luminiscencia de vida corta, emitida simultneamente con la excitacin.

La imagen muestra el principio de la fluorescencia. Arriba se observa el rayo incidente (color azul claro) de una determinada longitud de onda, el cual es absorbido por las partculas fluorescentes (esferas naranja) que responden emitiendo otra luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de onda mayor que la de la luz incidente.

Los trminos de fluorocromo y fluorforo definen los siguientes conceptos: Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigacin para crear contraste en zonas determinadas de los especmenes. Fluorforo: Parte de una molcula (fluorocromo, protena) que le imparte la propiedad de fluorescencia. Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorcin y de emisin especfico que depende de la composicin y estructura de la molcula fluorescente.

Algunos de los principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia y sus respectivos espectros de absorcin y emisin en valores aproximados.

La microscopa de fluorescencia es muy til porque la molcula fluorescente, an cuando sea muy pequea, puede ser observada debido a la luz que emite. Los fluorocromos actan como fuentes de luz de un color determinado que pueden ser localizadas en reas especficas de la muestra que se estudia. El marcaje selectivo de molculas y otros compuestos celulares se realiza mediante la tcnica de inmunofluorescencia.

Requerimientos para el microscopio de fluorescencia

Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el espectro especfico de cada fluorocromo. Hay que tomar en cuenta que la fluorescencia es pasajera y la iluminacin produce un efecto de fotoblanqueo en el fluorocromo; adems, las clulas vivas pueden ser daadas por la intensa radiacin. La luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lmparas de mercurio a alta presin que funcionan de un modo diferente a las lmparas de filamentos incandescentes. Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no deseadas. Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numrica.

Esquema bsico de la iluminacin en el microscopio de fluorescencia. La luz blanca emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo, solo la luz azul. El espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azul) pero deja pasar otras. Filtra la luz azul que excita al fluorocromo (fluorescena) pero por el contrario, deja pasar la luz verde emitida.

Aplicaciones del microscopio de fluorescencia

Son numerosas las aplicaciones de la microscopa de fluorescencia, notablemente en biologa y medicina: Marcaje de molculas en clulas y tejidos para su caracterizacin e identificacin. Estudio de clulas normales y patolgicas.
Estudios inmunolgicos. Mineraloga.

Microscopa de Fluorescencia
Colorantes Fluorescentes: cuando se exponen a la luz ultravioleta, se perciben como un cuerpo brillante sobre fondo oscuro. El color y la intensidad de luz que emiten es una propiedad caracterstica de la molcula fluorescente utilizada.
Los colorantes fluorescentes utilizados en la tincin de muestras clnicas, son detectados con ayuda del

Microscopio de Fluorescencia.

Microscopio de Fluorescencia-Contraste de Fases

Tipos de Microscopa de Fluorescencia

Primaria. La propia muestra posee fluorescencia.

Secundaria: muestra marcada con colorantes fluorescentes.

Inmunofluorescencia: la fijacin del colorante fluorescente se realiza con un anticuerpo marcado.

Inmunofluorescencia
La base de una prueba inmunolgica es la reaccin Antgeno-Anticuerpo.

Antgeno: tambin llamados inmungenos, son cualquier material que estimula la formacin de un anticuerpo. En su mayora son sustancias proteicas
Determinante Antignico: la parte por la que un antgeno se une al anticuerpo. Hapteno: pequeas molculas que no son capaces por s solas de estimular la formacin de anticuerpos, pero que unidas a otras molculas ms grandes, s lo hacen. Inmunoglobulinas: protenas cuya caracterstica definitoria es que en ellas reside la actividad de anticuerpo.

Inmunofluorescencia: Anticuerpos:
Estructura.

Anticuerpos
Funciones: Reconocer un determinado antgeno y combinarse con l. Esta caracterstica depende del idiotipo regin variable. Desencadenar una serie de consecuencias tras la unin con el antgeno, lo cual depende de la regin constante. Segn el tipo de inmunoglobulina, existen distintas posibilidades como capacidad de atravesar la placenta no, distribucin por el organismo, capacidad de fijarse a la superficie de determinadas clulas, capacidad de activar el complemento, etc.

Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia Directa: Son ensayos que estn limitados a la deteccin de antgeno, y que permiten el diagnstico de enfermedades bacterianas, fngicas, parasitarias y virales. Consiste en demostrar la presencia de un antgeno mediante reaccin directa con un un anticuerpo especfico, marcado con colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a travs de la inoculacin del microscopio productor del antgeno en un modelo animal Es un mtodo simple y rpido de realizar, con pocas reacciones inespecficas, sin embargo es menos sensible.

Inmunofluorescencia Directa

Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia Indirecta. Se puede usar tanto para la deteccin de antgenos como de anticuerpos. Es una tcnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato que puede ser un antgeno u otro anticuerpo, y se visualiza por tratamiento con un suero antiinmunoglobulina conjugado con fluorocromo.( por ejemplo : hepatocitos clulas Hep-2 si buscamos anticuerpos antinucleares, leishmanias si buscamos anticuerpos antileishmania, clulas que contienen virus, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum si buscamos anticuerpos contra estos agentes infecciosos ) Este mtodo es ms sensible y produce una fluorescencia de mayor brillo, sin embargo es menos especfico y puede dar lugar a mayor reactividad cruzada.

Inmunofluorescencia Indirecta

Inmunofluorescencia Indirecta: deteccin de Antgeno.

Fluorocromos.
Son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotn de una longitud de onda determinada cuando captan ( son excitados por ) un fotn incidente de una longitu de onda caracterstica.

Ejemplos: Isotiocianato de fluorescena: verde manzana. Rodamina: Naranja brillante. Caractersticas: Forman uniones con las protenas pero sin afectar los grupos de combinacin especfica del anticuerpo. La fluorescencia se ve afectada por el pH El fenmeno de fijacin disminuye la fluorescencia en 15% a 30% con respecto al colorante libre Las grandes intensidades de luz empleada, provocan tambin el desvanecimiento de la fluorescencia.

Imgenes Teidas con Fluorocromos

Mycobacterium

Neisseria

Treponema

Borrelia

Servicio Microscopa de fluorescencia en Colombia UDEA (Universidad de Antioquia Grupo de Neurociencias de Antioquia).

Universidad Nacional de Colombia Sede Bogot.

Universidad de Los Andes.

GRACIAS